旋涡混合器对脂肽化合物的分离纯化的应用

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生多种抗 菌次生代谢产物，被认为是具有潜在的、能有效抑 制病原菌并促进动植物生长的有益菌 ，具有很 高的农用及医用价值 。近年来，随着我国畜牧 养殖业不断发展，抗生素饲料添加剂造成的负面 影响严重影响了畜牧业的健康发展。抗菌脂肽作 为一种新型抗生素的替代品具有诸多优点，研发 和推广绿色、安全、健康、可持续养殖发展的抗生 素替代品已成为研究方向。

LB培养基、Landy培养基 、PDA培养基为 国产分析纯。

试验菌：4株枯草芽孢杆菌分别是GD株、SF-1 株、WT株和POC-4株，均分离自不同畜禽养殖场 周边环境土壤，由大连三仪生物工程研究所保存。 指示菌：致病性大肠杆菌 O2、金黄色葡萄球 菌（ATCC25923）、啤酒酵母菌（ATCC9763）、鸡白 痢沙门菌（CVCC2218）和桔青霉（AS3.2788）等标 准菌株，由中国微生物菌株保藏中心提供。

生物安全柜（Hfsafe-1800，上海力升科学仪器有限公司）；电热恒温培养箱（DNP-9022，上海精宏实验设备有限公司）；空气浴振荡培养箱 （HZQ-F160、HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开 发有限公司）；高速台式冷冻离心机（TGL-20M， 长沙湘仪离心机仪器有限公司）；旋涡混合器 （QL-866，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公 司）；凝胶成像系统（UVPGDS-8000，美国 UVP 公司）；高效液相仪（DIONEX U3000，美国DION⁃ EX公司）；液质（LC-MS）联用仪Agilent 6540（QTOF LC/MS，美国安捷伦公司）；电热恒温鼓风干 燥箱（DGG-9240A，上海森信实验仪器有限公 司）；电子天平（BS210S，北京赛多利斯有限公 司）；精密 PH 计（PHS-3C，上海虹益仪器有限公 司）；显微镜（XSZ-4G，重庆光电仪器有限公司）； 双槽玻璃层析缸（薄层色谱展开槽/展开缸）（P1- 2020，上海楚定分析仪器有限公司）；全自动立式 电热压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-S2，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

表面活性素（surfactin）（标准样品，美国Sigma 公司）；大孔树脂（XAD-16，上海宝曼生物科技有 限公司）；硅胶板（Silica Gel GF254 20 cm×5 cm， 上海科兴生物科技有限公司）；5%茚三酮溶液（乙 酸∶正丁醇=5∶95），乙酸、正丁醇、甲醇、无水乙 醇、盐酸、茚三酮等试剂（分析纯或色谱纯，国产）。

将各指示菌分别采用相应的固体平板培养基 进行复苏，37 ℃培养20 h（其中真菌采用28 ℃培 养36 h），再接种于装有50 mL LB培养液的250 mL 三角瓶，37 ℃、180 r/min培养20 h（其中真菌采用 28 ℃培养36 h），取出并通过平板计数法分别测定 指示菌数，并稀释至1×106 cfu/mL，4 ℃保存、备用。

将4株分离株枯草芽孢杆菌分别在LB平板上 活化，37 ℃培养20 h，分别取活化的单菌落转接于 装有50 mL LB培养液的250 mL三角瓶中，置37 ℃， 180 r/min，培养20 h。分别将各枯草芽孢杆菌再转 种到装有500 mL Landy培养液的3 000 mL三角瓶 中，接种量为5%，置32 ℃，180 r/min培养，备用。

取各分离株枯草芽孢杆菌24 h发酵液进行处 理，采用管碟法 ，对致病性大肠杆菌、沙门菌，金 黄色葡萄球菌、啤酒酵母菌、青霉素等指示菌分别 抑菌效果检测，设 3 个重复，1 个培养基阴性对 照，1个阳性对照（革兰氏阳性菌采用杆菌肽锌、 革兰氏阴性菌采用硫酸黏杆菌素、真菌采用两性 霉素，配置浓度参照中国药典规定配制），观测各 芽孢杆菌代谢产物的抑菌谱。

结果显示，不同分离株的枯草芽孢杆菌产生 的抑菌圈不同，同一分离株枯草芽孢杆菌对不同 指示菌的抑菌圈大小也不同；从抑菌圈来看，对真菌效果较好（20 mm左右），对革兰氏阳性葡萄球 菌抑菌效果明显（≥ 20 mm），好于革兰氏阴性菌抑 菌效果（D≈ 15~20 mm之间），其中分离株（GD）抑 菌圈达到20 mm，好于对照组。初步确 定GD株作为后续研究菌株。结果显示：硅胶板经过层析后，直接喷洒茚三 酮染色剂后加热，样品及标品表面活性素在相应 部位均没有显示，说明样品和标品中均没有游离 氨基酸存在，分子结构均为环状结构；采用浓HCl 进行原位水解后，在相应部位能见到标品及样品 的痕迹，再用茚三酮染色后，在对应位置处样品和 标品均能显色，说明样品和标品中已有游离氨基 酸存在，环状分子结构结构均已经打开。薄层板上样品与标品两个显色斑点所处的位置 比较表明，它们迁移的速度一致。初步判断该GD 株产生的抗菌产物与标品属于同一类脂肽化合物， 即表面活性素（urfactin）或表面活性素的同系物。

不同的芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指 示菌有不同的抑菌效果，对同种指示菌也有不 同的抑菌活性；同种芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指示菌有也有完全不同的抑菌效果。根据研 究资料显示，枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌 （B. amyloliquefaciens） 、短小芽孢杆菌（B. pum⁃ ilus） 、地衣芽孢杆菌（B. lichemformis） 、蜡样芽 孢杆菌（B. cereus）、苏芸金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） 、类芽孢杆菌（Paenibacillus）和 环状芽孢杆菌（Bacillus circulan）等均能产生抗 菌物质，产生的抗菌物质是否类似、以哪一种为主 要组分，有待于进一步研究。

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