脱色摇床对壹期矽肺纤维化形成干预作用

职业病危害仍然是我国目前严重影响劳动者 活动能力及导致劳动力丧失的主要原因，其中以矽 肺最为严重，占到尘肺总病例近 50% ，平均以每年 超过万例的速度在增长［1］。矽肺是由于长期吸入 游离二氧化硅( Si02 ) 含量较高的粉尘，达到一定量 后所引起的以肺间质纤维化为主的全身性疾病，其 病理改变为肺损伤、肺纤维化、矽结节形成。然而 矽肺的发病机理仍然不完全清楚，无早期诊断的特 异性指标，也无特异性的治疗药物和方法，一经确 诊，肺部病变则已经难以逆转。

清洁级 1. 5 月龄雄性 SD 大鼠，体 质量( 200 ± 10) g，购自南京医科大学，生产许可证: SCXK( 苏) 2016 － 0002，笼中鼠颗粒饲料饲养，自由 饮食，适应性饲养 1 周。

虎杖: 购自杭州市红十字会医院中药房。伊红: 国药集团( 71014544) ; 苏木素: Sigma ( H9627 ) ; 天 狼 星 红 染 液: YEASEN ( 36324ES60) ; Trizol: Invitrogen( ( 15596 － 018) ; Anti － bFGF antibody，: Affinity ( DF6038 ) ; Anti － PDGF antibody: Affinity( AF5179) ; Anti － TNF － α antibody: Affinity( DF6080) ; Anti － GAPDH antibody: Bioworld ( AP0063) 。

JT － 12J 型 脱 水 机: 武 汉 俊 杰; 100 型显微镜: 尼康; 9700 型 PCＲ 仪、7900 / Viia7 型实时荧光定量 PCＲ 仪 : ABI; Multiskan Spectrum 型酶 标 仪、CO2 细 胞 培 养 箱: Thermo Scientific; 5702Ｒ 型低速离心机: Eppendorf; H1650Ｒ 型高速冷 冻离心机: 上海卢湘仪。

12 只大鼠随机 分为模型组、对照组，每组 6 只，模型建立后，各组于 第 7、14、21 天 3 个时间点分别取 2 只大鼠将其处 死，取肺组织行常规 HE 染色，及 I、III 型胶原行天 狼猩红染色确定矽肺的病理分期情况，进行后续实 验。将 50 只健康雄性 SD 大鼠随机等分为 5 组，即 正常 组，模 型 组，虎 杖 低、中、高 剂 量 组，每 组 各 10 只。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，75% 酒精消 毒大鼠颈部皮肤，眼科剪沿中线剪开约 1. 2 cm 长切口，暴露气管后，吸取 1 mL SiO2 粉尘悬液，经软骨 间隙注射到气管内，将肌肉及皮下组织复位，缝合 皮肤并消毒。选择在矽肺早期( 第 7 ～ 21 天) 进行 如下处理 14 d: 正常组: 等量生理盐水灌胃，每天 1 次; 模型组: 等量生理盐水灌胃，每天1 次; 虎杖低 剂量组: 3. 0 mg / kg 虎杖水煎液灌胃，每天 1 次; 虎 杖中剂量组: 6. 0 mg / kg 虎杖水煎液灌胃，每天1 次; 虎杖高剂量组: 15. 0 mg / kg 虎杖水煎液灌胃，每天 1 次。在电泳即将结束 前，预 先 将 PVDF 膜 浸 泡 在 甲 醇 中 15 s，然 后 用 ddH2O 漂洗 2 min，浸泡于转移缓冲液中 5 min 后开 始后续操作; 在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移 缓冲液中平衡 15 min; 按黑面( 负极) →海绵→滤纸 →胶→PVDF 膜→滤纸→海绵→红面( 正极) 的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另 一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的 产生; 接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放 入电转仪中，加入转膜缓冲液; 将电转仪置于冰水 中，100 V 恒 压 转 膜 1 h; 转 膜 结 束 后，快 速 取 出 PVDF 膜，放入 5% BSA 室温封闭 2 h; 取出膜，于脱色摇床（TS-1000型）上用 TBST 洗膜 5 min × 3 次; 孵育袋中加入 TBST 稀释的 bFGF( 1∶ 500) 、PDGF( 1∶ 500) 、TNF － α( 1∶ 500) 和 GAPDH( 1∶ 5000) 4 ℃ 孵育过夜; TBST 洗膜 5 min × 3 次，辣根过氧化物酶( HＲP) 标记的二抗 ( 1∶ 3000) ，室温孵育 1 h; TBST 洗膜 10 min × 3 次。 膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带，取 出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好 PVDF 膜，暗 室中用 X 胶片感光、显影、定影。

预实验结果显示， 在第 7 天时，模型组大鼠肺泡壁增厚，并开始有少量 炎细胞浸润，并有细胞性矽结节出现，表明大鼠矽 肺模型开始进入Ⅰ期阶段; 在第 14 天时，肺泡间隔 增宽，肺泡间隔出现断裂，且有明显的炎细胞浸润， 细胞性矽结节增多，表明大鼠矽肺模型仍处在在 Ⅰ期阶段，但比在第 7 天时严重; 在第 21 天时，细胞 性矽结节形成增多，肺组织有少量成纤维细胞增 生，偶见纤维性结节，肺泡间隔断裂严重，表明大鼠 矽肺具备Ⅰ期、Ⅱ期的一些特点。HE 染色结果: 正 常对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄，结构正 常，周围未见明显的炎细胞浸润; 模型组大鼠肺泡 壁增厚，肺泡间隔增宽，肺泡间隔出现断裂，且有明 显的炎细胞浸润; 而虎杖各剂量组，随着虎杖剂量 的升高，炎细胞、肺泡壁增厚现象明显减少，肺泡间 隔有明显的恢复变窄。

矽肺的病情发生发展，中医认为本病多由外邪 袭肺，损伤肺脏，继而累及脾肾，后期及心，终为本 虚标实之证，引发喘促气急的症状。根据中医文献 中有关本病症状的描述，不同的发病阶段分别类属 于“咳嗽”“肺痹”“肺胀”等范畴，发作时特点与中 医学“哮证”相符，但病久燥伤肺津、肺气亏虚，肺体痿废不用，当属中医“肺痿”范畴。但病之初，外邪 袭肺，邪毒内陷于肺是该病病机关键所在。目前矽 肺引起的肺间质纤维化尚无特效治疗方法，因此若 能在发病早期找到有效靶点，阻断疾病的进程，无 论对于患者或者临床治疗均有重大意义。

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