脱色摇床对灌注损伤大鼠海马神经元的使用

缺血性脑卒中最有效的治疗方法是恢复梗死区 血流灌注，但由此引发的再灌注损伤问题也凸显出 来。脑缺血再灌注损伤是一个十分复杂的过程，神 经元凋亡在其损伤过程中起着重要作用，是损伤所致 一系列有害生化级联反应的结果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

60 只体质量 220～240 g 的 SPF 级 3 月龄雄性 SD 大鼠（三峡大学实验动物中心，许可证号： SCXK（鄂）2012-0068），按照随机数字表分为假手 术组、缺血/再灌注组和电针预处理组，每组 20 只。饲 养于湖北中医药大学实验动物中心，室温 20~25 ℃， 光照时间（7：00-19：00）。本实验过程中对动物的 处置严格按照科技部398 号《关于善待实验 动物的指导性意见》文件要求进行。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：p53 抗体、caspase-3 抗体（批号分 别为 sc-71820、sc-271759，Santa 公司）；TUNEL 试剂盒（批号为 11684817910，Roche 公司）；TTC 染色液（批号为 A610558-0025，Sangon Biotech 公 司）；DAB 显色剂（K5007，DAKO 公司）。 主要仪器：3400 线栓（广州佳灵）；RM2016病理切片机 （上海徕卡仪器有限公司 ） ； Nikon Eclipse Ti-SR 倒置荧光显微镜、Nikon DS-U3 成像系 统（日本尼康）；HANS-200 电针治疗仪（北京华运 安特科技有限责任公司）；华佗牌毫针（0.25 mm× 13 mm，苏州医疗用品厂）。

1.3 模型制备

缺血/再灌注组和电针预处理组，参照 Longa 等造模方法，建立大鼠右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模 型。大鼠禁食 12 h，仰卧位固定，2%戊巴比妥钠溶液 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，消毒后沿颈部正中剪一 切口，长约 2 cm，向右纵行逐层钝性分离肌肉及筋膜， 在颈前肌群近前斜角肌端处游离右侧颈总动脉（CCA） 及其分支颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），术中 注意保护迷走神经。

1.4 干预方法

电针预处理组造模前先进行电针干预，参照华 兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》取穴，“百 会”位于大鼠顶骨正中，“肾俞”位于第 2 腰椎下两 旁，“三阴交”位于后肢内踝尖直上 10 mm，其中 “百会”经皮沿脑正中线向额斜刺约 2 mm，“肾 俞”直刺约 6 mm，“三阴交”直刺 4~5 mm。同侧“肾 俞”和“三阴交”接成一对电极，“百会”与其旁 开 1 cm 处提捏皮肤浅刺 1 mm 的辅助电极接成一对 电极，接 HANS-200 电针治疗仪，予疏密波，频率 2 Hz/100 Hz，强度 1 mA，通电 10 min，留针不通电 5 min，连续重复 4 次，共计 1 h。电针干预结束后 观察 30 min 行造模手术。此过 程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后 将玻片置于 PBS（pH=7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5 min。3% H2O2溶液阻断内源性过氧化物 酶，加兔抗 p53 抗体、兔抗 caspase-3 抗体（1∶ 200）孵育过夜，滴加二抗，DAB 显色，显微镜下 控制显色时间，阳性为棕黄色，流水冲洗切片终止 显色，脱水封片。每组 10 个样本，每个样本切片在 海马 CA3 区随机挑选 3 个 200 倍视野进行拍照，应 用 Image-Pro Plus 6.0 软件对每张照片进行分析得出 阳性区域的累积吸光度，取其均数为该样本的 IOD 值，IOD 值越大，阳性表达越强。

2 结果

假手术组无神经功能丧失；缺血/再灌注组神经 行为学改变明显，大鼠左前肢明显不能充分伸展， 或向左环行运动，出现轻度局灶神经功能丧失，或 向左侧倒，出现中度局灶神经功能丧失；电针预处 理组神经行为学症状较缺血/再灌注组明显减轻。 缺血/再灌注组神经行为学评分明显高于假手术组 （P＜0.01）；缺血/再灌注组和电针预处理组神经 行为学评分分别为 2.95±0.22 和 1.75±0.64，电针 预处理组明显低于缺血/再灌注组（P＜0.01）。见 图 1。

假手术组大鼠右侧未见脑梗死灶，缺血/再灌注 组大鼠右侧脑梗死灶明显，两组间脑梗死百分比比 较，差异有统计学意义（P＜0.01）；与缺血/再灌注 组比较，电针预处理组大鼠右侧梗死面积明显减小 （P＜0.01）。见图 2。缺血/再灌注组右侧海马 CA3 区 p53 阳性表达明显增多（P＜0.01）；与缺血/ 再灌注组比较，电针预处理组右侧海马 CA3 区 p53 阳性表达量明显减少（P＜0.01）。caspase-3 为细胞 质着色，阳性细胞呈棕黄色，其中假手术组大鼠右侧 海马 CA3 区仅有极少量神经元胞质黄染，缺血/再灌 注组右侧海马 CA3 区大量神经元胞质黄染，caspase-3 的阳性表达明显增多（P＜0.01）；与缺血/再灌注组 比较，电针预处理组右侧海马 CA3 区 caspase-3 的 阳性表达明显减少（P＜0.01）。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤的发生机制十分复杂，包括 炎性反应、氧化应激、细胞凋亡、兴奋性毒性等， 这些因素彼此关联，相互重叠，最终导致缺血区细 胞损伤、凋亡甚至坏死，进而引起脑功能障碍 。 研究表明，神经元凋亡是脑缺血再灌注损伤所致 一系列有害生化级联反应（这些反应包括钙稳态失 衡所致兴奋性中毒，内质网及线粒体功能受损，自 由基氧化应激引发 DNA 损害，促凋亡基因表达的上 调，效应半胱氨酸蛋白酶的激活，核酸内切酶降解 基因组等）的结果，是脑缺血再灌注损伤的重要发 生机制之一。



 

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