白酒酒曲真菌群落结构的分析(GL-88B使用)

在我国常采用大曲、小曲和麸曲生产白酒，固态发酵 生产白酒方法中，大曲既是一种粗制酶制剂，又是一种糖 化发酵剂，同时也起生香作用。由于大曲是自然培养而 成的，所以含有霉菌、酵母、细菌等多种微生物种群及其产 生的蛋白酶酶系、淀粉酶酶系及风味酶酶系等复合酶系， 是一种多菌种的混合酶制剂，为形成复杂的香气成分起 重要作用，由此可见，曲的优劣与酒的质量和酒体风格直 接相关，名酒之所以为名酒，名在质量，贵在风格。微生物 在白酒酿造中起着主要作用，因此了解微生物在酒曲培养以及白酒酿造过程中的习性和作用，不仅有利于提高白酒 质量，而且可满足消费者对于曲酒类型的不同需求以及对 曲酒品质的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

浓香型白酒中高温曲（1月龄、2月龄、4月龄，分别命名 为Z1、Z2、Z3）、芝麻香型白酒高温曲（命名为AA1）：均取 自河南省宋河酒业股份有限公司。样品采集后迅速粉碎密 封，-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

Taq脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合 酶（5 U/μL）：美国Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取试 剂盒：美国OMEGA公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒： 生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA检测试 剂盒：美国Life公司。

1.2 仪器与设备

Mastercycler PCR仪：德国Eppendorf公司；Pico-21台式 离心机：美国Thermo Fisher公司；其林贝尔GL-88B漩涡混合器：其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H混匀型干式恒温器： 拓能达科技有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂； GelDoc-ItTS3凝胶成像系统：美国UVP公司；Miseq高通量 测序仪：美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物总DNA的提取按照DNA提取试剂盒说 明书中的方法和步骤进行。

1.3.2 聚合酶链式反应及测序

以总DNA为模板，采用Miseq测序平台的通用引物 ITS1（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode） CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）对酒曲中真菌的ITS序列进行 PCR扩增。PCR扩增体系：10×PCR buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三 磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.1 mmol/L， DNA 10 ng，ITS1 0.5 μmol/L，ITS2-Rev 0.5 μmol/L，Plantium Taq 0.05 U，用双蒸水补充至50 μL。 PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃ 退火20 s，65 ℃延伸30 s，共计5个循环；然后94 ℃变性20 s， 45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共计20个循环；最后72 ℃延 伸5 min。 PCR扩增结束后，PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，利用 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。利用 Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的PCR扩增产物进行精确 定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3.3 数据分析

将测序获取的原始序列的双末端序列融合成一个方 向的序列并进行质量控制（quality control，QC），方法如下：
（1）序列的融合，采用1.2.3 Flash软件融合双末端的序 列，通过各个样品的barcode使数据回归样品，并对各个样 品序列进行质量控制。
（2）QC分析：采用V0.20.4 Prinseq软件对序列阅读框的 3'端进行质控，去掉碱基质量（Q）值＜20的数据，提高后续 序列的融合比率；通过Flash软件融合双末端序列，使其形 成一条序列；采用Prinseq软件去除各个样品的引物序列、小 于200 bp的序列、低质量序列和低复杂度序列；截掉非靶区 域序列和嵌合体，首先采用1.30.1 Mothur软件的Pre. cluster 模块校正测序错误，校正过程中允许的最大错配是1/150。 然后，以Silva数据库中的序列作为模板，采用Uchime功能 模块去掉嵌合体和非靶区域序列。

2 结果与分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq测序平台得到Z1、Z2、Z3、AA1样 本对应的原始序列分别为49 404条、51 278条、64 658条和 98 202条，其平均长度分别为317.72 bp、304.71 bp、296.31 bp 和254.15 bp，经拼接、过滤，分别得到有效序列49 389条、 51 246条、64 587条和97 934条，其平均长度分别为273.91 bp、 261.13 bp 、252.28 bp和211.03 bp。

2.2 序列丰富度和多样性分析

香农（Shannon）指数、ACE指数、Chaol指数、辛普森 （Simpson）指数和Coverage指数是常用于描述微生物群落 物种多样性的Alpha多样性指数，这5个多样性指数可以对 群落物种组成的丰富度及群落物种组成的均匀度进行综 合性的评价，5个多样性指数中的Shannon指数对微生物群 落物种多样性更为敏感。其中，Shannon指数越大，群落物 种的多样性越高；Chaol指数或ACE指数越大表明群落物 种丰富度越高；由Coverage指数可知本次实验的取样是否 合理，若Coverage指数＞97%，则证明本次取样是合理的；但Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。基于高通 量测序技术对浓香型白酒中高温曲和芝麻香型白酒高温 曲中真菌的序列数量、操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多样性指数进行研究，结果见表1。

对数值上略有差异，但都可以看出测序数据量已足 够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。通过对4个 样本对比分析可知，在浓香型白酒中高温曲中，样品Z3的 Chao1指数值（668.43）最大，说明Z3样本的真菌群落物种丰 富度最高；样品Z2的Shannon指数值（1.42）最大且Simpson 指数值（0.36）最小，说明样品Z2的真菌群落多样性最高。 芝麻香型白酒高温曲样本AA1的Chao1指数值（764.45）和 Shannon指数值（2.65）都比浓香型白酒中高温曲的指数值 大，因此，芝麻香型高温曲的真菌物种丰富度和真菌群落 多样性都比浓香型白酒中高温曲的大。4个样品的Coverage 指数都＞97%，说明本次取样是合理的，测序结果能反映 样本的真实情况。

2.3 香农指数曲线分析

香农指数曲线反映样品中微生物多样性，可以用于比 较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用于说 明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明 测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU， 反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。

3 结论

本实验基于Illumina MiSeq高通量测序研究了宋河酒 业浓香型白酒中高温酒曲和芝麻香型白酒高温酒曲中的 真菌群落结构。在属的分类水平上分析，浓香型白酒中高 温酒曲的优势真菌群（相对丰度≥1%）主要有假丝酵母 （Candida）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、根毛霉属（Rhizomucor）等。芝麻香型白酒高温酒曲的优势真菌群主要有 假丝酵母（Candida）、曲霉属（Aspergillus）、威克汉姆酵母 （Wickerhamomyces）等。随着浓香型白酒中高温酒曲贮存 时间的延长，假丝酵母（Candida）的相对丰度逐渐增加，其 在两种酒曲中都是优势真菌，此属中有许多种具有酒精发 酵的能力。采用高通量测序技术对酒曲中的菌落物种分类 研究，操作简单、通量高、信息丰富，和传统方法比较具有 一定的优越性。该研究成果为进一步研究优化制曲工艺、 提高酒曲质量指明了方向，具有重要的理论和实践意义。



 

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