酒精性肝损伤大鼠的保护作用分析（恒温震荡仪

人胳带间充质干 细胞（ ｕｍｂ ｉ ｌｉ ｃａｌ ｃｏ ｒｄ ｍｅｓｅ ｎｃ ｈ？ ｙｍａｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ， Ｕ Ｃ ＭＳＣｓ ） 数量丰 富 ， 在组织 工程 和 细胞 治疗领 域具有很大 的应用 价值 。 近年来 ， 研 究发现人 ＵＣＭ ＳＣ ｓ 具有 免疫调节 和 分化为 肝细 胞 的 能力 ， 在治疗肝脏疾病方面有 显著 的 疗效。

１ 材料与方法 

１ ． １ 动物 、 试剂 、 药物与仪器

４０ 只 健康 Ｓ Ｄ 大 鼠 ， 体 质量为 （ １ １ ０ ± ２ ０ ） ｇ ， 雌雄 各半 ， 购 自 北京维通 利 华 实 验 技 术 有 限 公 司 【 许 可 证 号 Ｓ ＣＸＫ （ 京 ） ２ ０ １ １ －００ １ １ 】 。 ＩＩ 型胶原酶（ Ｓｉ ｇｍａ ， 美 国 ） ； Ｄ － Ｈａ ｎｋ ’ ｓ 液 、 胎 牛 血清 、 ＤＭＥ Ｍ／Ｆ １ ２ 培养基 、 ０ ． ２５ ％胰蛋 白 酶 、 Ｍｅｓ ｅ ｎ ＰＲＯ Ｒ ＳＴＭＭｅ ｄｉ ｕｍ （ Ｇｉ ｂｉ ｃ ｏ ， 美 国 ） ； 市 售 ５ ６ ？ 红星二锅头 ； 检测血清丙氨 酸氨基转移酶（ ＡＬＴ ） 、 天 门 冬氨酸氨基转移酶 （ ＡＳＴ ） 、 丙二酸（ ＭＤＡ ） 、 超氧化 物歧化酶 （ ＳＯ Ｄ ） 、 谷胱 甘肽过 氧化物酶 （ ＧＰｘ ） 试剂 盒（ 南京建成 生物 工程研究所 ） ； 苏木精 － 伊红染色 液（ 北京索莱宝） ； Ｔｒａｎｓ Ｓｃ ｒ ｉｐ ｔ Ｏｎ ｅ － Ｓｔ ｅｐ ｃ Ｄ ＮＡ 合成 试剂盒和 Ｔａｐ ＰＣ Ｒ Ｍｉｘ （ 北 京全式金生 物技术有限 公司 ） ； ＣＹＰ２Ｂ １ 引 物设计及合成 （ 金斯瑞生物科技 公司 ） 。 ＧＬ 为本实验室 自 制 ｄ 光学显微镜（ Ｏｌ ｙ ｍｐｕｓ ， 日 本 ） ； 低温 高 速离心 机（ Ｔｈｅｒｍｏ ， 美 国 ） ； ＰＣ Ｒ 分析 仪 （ ＡＢ Ｉ ， 美 国 ） ； 酶标仪 （ Ｂ ｉ ｏ Ｔ ｅｋ ， 美 国 ） ； 恒 温震荡 仪（ 其林贝尔仪器设备有 限公司 ） ； ６ 孔板 、 培养瓶 、 培养皿（ Ｃｏ ｍｉｎ ｇ ， 美 国 ） 。 

１ ． ２ Ｕ Ｃ ＭＳＣ ｓ 培养

经医院 医学伦理委员会 批准。 经过产妇知 情同 意后 ， 采集正常 足 月 剖宫产 健康胎儿脐带组织 ， 置人 Ｈａ ｎｋ ’ ｓ 液 ， ４ 尤保存 。 在 超净 台 内 取 出 胳带 ， 用 ＰＢ Ｓ 冲洗血液 ， 用 手术 刀剔 除胳 带 内血管 ， 将脐带剪成 １ ￣ ２ ＿３ 组织块 ， 放 人培养瓶 ， 加人 Ｉ Ｉ 型 胶原酶消 化 ， 过滤 、 收集 细胞 ， 接种在 ６ 孔板内 ， 置于 Ｃ ０２ 培养箱 内 培 养。 ９６ ｈ 后半量更 换培养液 ， 以 后 隔 半天半量换 液 ， 显微镜 下 观察 ， 大约 １ ０ ｄ 后 ， 细 胞融合达到 ８ ０ ％时 ， 进行 传 代培 养。

 １ ． ３ 慢性 ＡＬＤ 动 物模型 的 建 立与 细胞移植 

干预 ｎ 取 ４ ０ 只 ＳＤ 大 鼠 ， 正常词养 １ ｗ ， 给予其 中 ３０ 只 白 酒 １ ０ ｍｌ ’ ｋｇ － １ 灌 胃 ， 早 晚各一 次 ， 连续 ３ ０ ｄ 。 待大 鼠状态 变差 ， 活 动减少 ， 精神 萎靡 ， 毛 发无光 泽时 ， 即 建立慢性 ＡＬＤ 模型成功 。 将 ＡＬＤ 动物 随机分 为 模型 组 （ Ｂ 组 ） 、 脐带 间 充质干 细胞移 植组（ Ｃ 组 ） 和 脐带间 充质干细胞联合甘草酸处理组（ Ｄ 组 ） 。 给予 Ｂ 组动物生 理盐水 〗 ｍｌ ， 给予 Ｃ 组 动物 Ｕ ＣＭＳ Ｃｓ （ １ ｘ ｌ Ｏ Ｄｌ ｍｌ ， 给 予 Ｄ 组 动 物 ＵＣ ＭＳＣ ｓ （ ｌ ｘ １ ０ Ｗ ／Ｌ ） 和 甘草酸（ １ ００ ｍｇ ‘ ｋｇ ＿ ｌ ） ｌ ｍｌ ， 门静脉注射 ， 另 １ ０ 只 为对照 组（ Ａ 组 ） ， 给予生理盐水 １ ｍ ｌ 门 静脉 注射。 １ ． ４ 血清检测 在细 胞移植 ２ ｗ 后 ， 经尾静脉取血 ， ４Ｘ； 、 ４ ０００ ｒ／ｍ 离心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 分离 血清 ， 于 － ２０ Ｔ： 冰 箱保存 ， 备测。 

１ ． ５ 肝组织病理学检查

 取血后 ， 即 刻取出 肝脏 ， 取 部分肝组织用 １ ０ ％甲 醛 固定 ， 常规石蜡包埋 切片 ， ＨＥ 染色 ， 光学显微镜下观察 。 

１ ． ６ 肝组织细 

胞色素 Ｐ４５ ０ 亚 酶 （ ＣＹ Ｐ２ Ｂ １ ） ｍＲＮＡ 水 平检测 采用 ＲＴ －ＰＣＲ 法 ， 在液 氮 中 研磨 肝组 织 ， 加 人 Ｔｒｉ ｚｄ 溶液提取 总 ＲＮ Ａ 。 应用核酸蛋 白 仪 和琼脂糖 电泳对提取 的 ＲＮＡ 进行分析。 取 总 ＲＮＡ ４ ｝ ＾， ８ ２ １ 水浴 ５ 以１１ ， 加 人反转录 反应液 ， ４４ ￡ £ 孵 育 ６０ ｍｉ ｎ ， 留 取产物待用 。扩增参数 ， ９ ５ １ １ ０ ｍｉ ｎ ， ６ ０ Ｔ； ５ ０ ｓ ， ７２ Ｔ： 延伸 ５０ ｓ ， ７ ２ Ｔ： 延 伸 １ ０ ｍ ｉ ｎ Ｊ Ｏ Ｔ 保存 。 基 因 水平分析采 用 ２ － ｍ 法 ， 将 ＧＡＰＤＨ 设 为 内 参 ， 取 Ｃ ｔ 值 。 计算公式为 ： Ａ Ｃｔ ＝ Ｃｔ （ 目 的基 因 ） － Ｃｔ （ ＧＡ ＰＤＨ ） ； Ａ Ａ Ｃｔ ＝ Ａ Ｃｔ （ 实 验组 ） － 么 ０ （ 对照组 ） 。

２ 结果

２ ． １ 肝组织病 

理学变化 Ａ 组 大 鼠 肝组织结 构完整 ， 肝 小叶结 构 清晰 ， 细胞形态规则 ， 细胞 核 圆 形 ， 胞 质丰满 ， 无异常改 变（ 图 １ Ａ ） ； Ｂ 组 大鼠肝小 叶 界 限 不清 晰 ， 肝细 胞索排列紊乱 ， 细 胞核模糊 不清 ， 肝 细胞胞质 内 有大小不等的 圆 形脂肮空泡 ， 部分肝细 胞 肿胀， 可 见点 灶坏死 和 部分炎性 细 胞 浸润 （ 图１ Ｂ ） ； Ｃ 组和 Ｄ 组肝损 伤有不同 程 度 的 减轻 ， 以 Ｄ 组 减轻较明 显（ 图 １ Ｃ 、 图 １ Ｄ ） 。

２． ２ ＵＣＭＳ Ｃｓ 形态学观察结果

 体 外培 养细 胞 ３ ￣ ５ ｈ ， 细 胞开始贴壁 ， ４ ８ ｈ 完 全贴壁 ， 出 现 长梭形 和少 量成纤维样细 胞。 随着 传代次数 的增加 ， 成纤维样的 Ｕ Ｃ Ｍ ＳＣ ｓ 增殖 速度加 快 ， 扩 增纯化后 的 第 ３ 代脐带 间 充质干 细胞形态似长梭形 ， 呈辐射状生长（ 图 ２ ） 。

２ ． ３ 各组大 鼠 血清指标水平

 比 较 与 Ａ 组 比 ， Ｂ 组大鼠 血清 Ａ ＳＴ 、 ＡＬＴ 和 Ｍ Ｄ Ａ 水平显 著升高 ， 而 Ｓ Ｏ Ｄ 和 ＧＰｘ 水 平显著降低 ； 与 Ｂ 组 比 ， Ｃ 组和 Ｄ 组血清 ＡＳＴ 、 Ａ ＬＴ 和 Ｍ ＤＡ 水 平显著下降 （ ｆ ＜ ０． ０５ ） ， ＳＯ Ｄ 和 ＧＰｘ 水平显著 升高  。

３ 讨论 

研究指 出 ， 酒精 中 的 乙 醇在代谢时产生大量 的 自 由 基 ， 致使肝细 胞膜 发生 脂质过 氧化 ， 能引 起 肝 脏组织 中 的肝细 胞损 伤和 死亡 ， 导致转氨酶升高 。酒精 代谢过程 中 产生 的 乙 醛会对肝细胞产生 毒性 作用 ， 抑制 谷胱； 甘 肽（ ｇ ｌ ｕ ｔ ａｔ ｈ ｉ ｏ ｎｅ ， ＧＳＨ ） 的合成 ， 减弱 ＳＯ Ｄ 等抗 氧化能力 ， 导致大量 ＭＤ Ａ 等 氧化物 的 生 成ｉ ８ ＼ Ｍ Ｄ Ａ 的含量可 以 反映 出 机体细胞 受 自 由 基攻 击 的 程 度 ， Ｓ Ｏ Ｄ 、 ＧＳ Ｈ 的 活 性 高 低是 反 映 机体抗 氧 化能 力 的指标Ｍ。 Ａ ＴＬ 和 Ａ ＳＴ 存 在 于 肝细胞浆 中 ， 当 肝细 胞受损 时 ， 可使血 清 Ａ ＴＬ 和 Ａ ＳＴ 水平升 高 ，是肝损 伤 的敏感指标 。

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