浅谈皮细胞损伤的作用机制分析

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种 成分，细菌裂解后进入宿主体内，能引起内毒素血 症，刺激机体炎症因子的产生增加，产生局部或系 统性炎症反应。大鼠肠隐窝上皮细胞（intestial epithelial cell line，IEC-6），为肠黏膜屏障的组成部 分，LPS 可诱导 IEC-6 细胞发生炎症反应，炎症介 质引起紧密连接（TJ）复合物结构、细胞骨架和细胞通 透性的改变，这种炎症反应的发生将损害肠黏膜的 屏障功能 。

1 材料与方法

1.1 动物

SD 大鼠（230~270 g），SPF 级，雄性，购 于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号： SCXK（湘）2016-0002。

1.2 细胞株

IEC-6 细胞，购于中国医学科学研究院 基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.3 药物及试剂

参苓白术散，北京汉典制药有限公 司，批号：Z20040146；脂多糖（LPS），美国 Sigma 公司产品，批号：025M4040V；TRIzol Reagent，北 京全式金公司，批号：K10526；MTT 细胞增殖试剂 盒，南京凯基生物有限公司，批号：20161229；IL8 ELISA 试剂盒，欣博盛生物科技有限公司，批号： ERC008；mcherry-GFP-LC3 双标腺病毒，汉恒生物 科技（上海）有限公司，批号：AP07071804；两步 RT-PCR 试剂盒（批号：AE301）、100bp Plus DNA Ladder（批号：K20415），北京全式金公司；琼脂糖 （Agarose）， Genview 公 司 ， 批 号 ： 2B180205600； GoldView I 型核酸染料（批号：41230）、50×TAE 电泳液（批号：20141021），北京索莱宝公司； GAPDH、 ATG5、 ATG12、 ATG13、 ATG1611、 ATG1612 引 物，生工生物工程（上海）有限公司。

1.4 仪器

I 类 B 型医用超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MCO175 型细胞培养箱，日本 SANYO 公司；S40-SLIDER 倒置普通光学显微镜、 DMI3000B 型荧光倒置显微镜，德国 Leica 公司； Elx800 型酶标仪，美国 BioTek 公司；PCR 仪，德国 Eppendorf 公司。

2 结果

当 LPS 浓度达到 100 μg · mL-1 时，细胞活力值 与空白组比较开始出现明显差异（P < 0.05），该浓度 下细胞抑制率为 29.3 %，因此选用 100 μg · mL-1 的 LPS 浓度为后期 IEC-6 细胞炎症模型的造模浓度。与对照组比较，不 同浓度含量的参苓白术散含药血清对 IEC-6 细胞活 力均无明显作用（P > 0.05）。mRFP -GFP -LC3 腺病毒滴 度为 1010 pf μ·mL-1 。从图 4 可以看出，加入浓度梯 度为每孔 0.1、0.2、0.4、0.8 μL 的 mcherry- GFPLC3 腺病毒转染 IEC-6 细胞，腺病毒转染率和荧光 强度随腺病毒浓度的加大而增强。每孔加入 0.4 μL 腺病毒时 IEC-6 细胞转染率高，荧光强度最强，且 显微镜下观察细胞形态较 0.8 μL 腺病毒组正常，故 选取每孔加入 0.4 μL mRFP-GFP-LC3 腺病毒量作为 感染 IEC-6 细胞正式实验的浓度。与空白组比 较，模型组中自噬体斑点形成明显减少或消失（P < 0.05）；与模型组比较，参苓白术散含药血清组、自 噬诱导剂 Rapamycin 组的自噬斑点形成明显增加，自 噬活力增强（P < 0.05）；自噬抑制剂 3-MA 组与模型 组比没有差别，自噬斑点稀少（P < 0.05）。结果表明 参苓白术散能促进损伤的 IEC-6 细胞发生自噬。

3 讨论

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种以细胞质空泡自噬化为特征的溶酶体依赖性降解途径，实现细 胞本身代谢需要和某些细胞器更新，主要与细胞的 存活、分化、发育和内环境稳态的维持密切相关， 在维持肠黏膜免疫系统稳态中发挥重要作用，细胞 自噬同样发挥着重要作用。近期研究也证实在肠上 皮细胞中，自噬基因 ATG16L1 可负性调控 IL-1β 诱 导的炎症因子表达 ，任彩瑗等发现细胞自噬可通 过调控 NF-κB 分子信号通路抑制 LPS 诱导的炎症反应。