微量振荡器在类酶联免疫分析法中的分析

多环芳烃( Polycyclic Aromatic Hydrocarbons， PAHs) ，是一大类广泛存在于环境中的持久性有机 污染物，主要来源是各种矿物燃料及其他有机物 的不完全燃烧和热解过程。据报道，PAHs 本身没 有急性毒性且不具有直接致癌性，但多环芳烃 的代谢物具有结合细胞蛋白质和 DNA 的能力，因 此多环芳烃可以诱导 DNA 损伤，从而具有较高的 毒性: 有害的生物效应、毒性、致突变性和致癌性， 同时也可以作为共致癌物或肿瘤促进剂。目前， 已发现 400 多种多环芳烃及其衍生物可以诱导人体 产生癌症。多环芳烃具有半挥发性，且随分子量 增加蒸气压降低，多环芳烃也就越容易挥发。可以 蒸汽形式，借助吸附于颗粒物来实现在大气环境中远距离的迁移，从而造成全球环境的极大污染。 目前，美国环保局和我国分别将其中的 16 种类别和 7 种类别的 PAHs 确定为优先控制污染物。PAHs 分布 广 泛，在 土 壤、水 体、食品和空气中均有发 现。因此，多环芳烃长期以来受到全世界各国的 关注，一直是国内外研究的环境污染物中的热点和重要课题。

1) 包被缓冲液: 0. 05 mol /L 碳酸盐缓冲液。 准确称取 NaHCO3 2. 93 g、Na2CO3 1. 59 g，加蒸 馏水搅拌溶解，最后定容于 1 000 mL 容量瓶。用 1 mol / L HCl 和 1 mol /L NaOH 调节溶液 pH 值至 7. 4。 2) 洗涤液( PBS-T) 。

3) 封闭液( 1% 明胶) 。 准确称取明胶 1 g，用 0. 01 mol /L PBS ( pH = 7. 4) 经磁力搅拌溶解并定容于 100 mL 容量瓶。

4) 底物缓冲液。 A 液: 准确称取柠檬酸 2. 1 g，加入蒸馏水溶解， 定容于 100 mL 容量瓶。 B 液: 准确称取 Na2HPO4·12H2O 7. 664 g，加入 蒸馏水溶解，定容于 100 mL 容量瓶。 准确量取 A 液 2. 43 mL，B 液 2. 57 mL 混合后， 加蒸馏水并定容于 10 mL 容 量 瓶，调 节 pH 值 至 5. 0，该试剂需现用现配。

5) 显色液。 准确称取 TMB 10 mg，加入 4 mL 乙醇溶解，制 备 TMB 储存液，于 4 ℃ 避光保存。使用时，取 TMB 储存液 0. 4 mL，底物缓冲液 10 mL 和 30% H2O2 10 μL，混合均匀，该试剂需现用现配。

6) 终止液: 2 mol /L H2 SO4 溶液。 准确量取浓硫酸 22. 2 mL，加入蒸馏水稀释，待 冷却后定容于 200 mL 容量瓶． 丙酮( 色谱纯) 、乙腈( 色谱纯) 、萘( 99% ) 、菲 ( 95% ) 、乙醇( 色谱纯) 、NaOH( 分析纯) 、HCl( 分析 纯) 等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司; 苊 ( 98% ) 、荧蒽( 98% ) 、芘( 97% ) 购于阿拉丁生物有 限公司; 酶标蒽购于北京翰谱生物有限公司; 试验所 用的水均为 AD-SＲ05 超纯水系统所制备。

EL800-PC 酶标仪，美国 BIO-TEK 公司; 96 孔酶 标板，生工生物有限公司; BSD-100 恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂; BCD-208K /A CJN 冷藏冷冻箱，青岛海尔股份有限公司; MH-I 型微量 振荡器，海门其林贝尔仪器制造有限公司; 8 道可调 移液器，Eppendorf; QP2010ΜLtra 气相色谱-质谱联 用仪，岛津企业管理中国有限公司; UltiMate3000 高 效液相色谱仪( 配备紫外检测器) ，赛默飞世尔科技 中国有限公司。

将芳香烃受体蛋白用碳酸盐缓冲液( pH = 7. 4) 按体积比 1∶ 200、1∶ 400、1∶ 600、1∶ 800、1∶ 1 000、1 ∶ 2 000 和 1∶ 3 000 稀释，然后向 96 孔酶标板中每孔 加入 100 μL 溶液，于 4 ℃条件下包被过夜 12 h。倒 出孔内液体，用洗涤液 PBS-T 振荡洗涤 3 次，每次 3 min，滤纸上拍干; 每孔加 1% 明胶 200 μL，于 37 ℃ 封闭反应 60 min，倒出孔内液体，重复洗涤的步骤， 滤纸上拍干。将酶标蒽用 PBS 按体积比 1 ∶ 400、 1∶ 800、1∶ 1 000、1∶ 1 600、1∶ 2 000 和 1∶ 3 000、1∶ 4 000、 1∶ 5 000稀释，每孔加入 100 μL，重复上述试验操作步 骤，同时设置蒸馏水做空白对照，于37 ℃温育6 min; 重 复洗涤的步骤，滤纸上拍干; 每孔加入 TMB 底物溶液 100 μL，室温下显色反应 40 min，之后每孔加入 50 μL 终止液终止反应，采用酶标仪于450 nm 处测定 OD 值。

在上述优选工作条件下，测定不同质量浓度多 环芳烃对酶标蒽与蛋白结合的抑制率。具体操作步 骤: 配制质量浓度梯度为 0、1 ng /mL、5 ng /mL、10 ng /mL、50 ng /mL、100 ng /mL 的系列多环芳烃标准 液，分别取 10 μL 标准液与酶标蒽混合，按照上述步 骤操作，用酶标仪检测 OD450 的值，并绘制标准曲 线，计算 80% 抑制率的多环芳烃质量浓度为最低有 效检测质量浓度。 将 1 ng /mL、5 ng /mL 水平分别加标至 5 ng /mL 和 10 ng /mL，用 ELISA 重复检测 5 次，计算重复性 和加标回收率。

色谱 柱 为 ODS-3 柱 ( 250 mm × 4. 6 mm × 5 μm) ，等度洗脱，V( 乙腈) ∶ V( 蒸馏水) = 80∶ 20，进样 量 20 μL，流速为 1. 2 mL /min，紫外检测波长为 232 nm，柱温为 30 ℃。

色谱柱为 DB-5ms 柱( 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm) ，进样口温度为280 ℃，不分流，进样量1 μL，柱 流量 1. 0 mL /min，柱 温 80 ℃ 保 持 2 min，以 20 ℃ /min 速率升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃ /min 速率升至 290 ℃，保持 5 min。

由于配体受体结合过程是动态平衡，结合形成 的复合物可在一定条件下解离。配体和受体质量浓 度比例合适时，结合能力最大，产生的复合物最多、 反应速度最快。配体受体结合是可以达到饱和的， 因此当两者比例未达到合适范围时，复合物的产量 降低，反应速度下降，甚至不发生反应。试验中采用方阵滴定法可在较大的范围内显示 出芳香烃受体蛋白和酶标蒽的工作质量浓度情况， 结果见图 1。从图 1 可见当芳香烃受体蛋白的稀释 倍数为 2 000，酶标蒽的稀释倍数为 400 时，吸收值 达到峰值( 0. 436) 。因此选择此稀释倍数为芳香烃 受体蛋白和酶标蒽的最适合质量浓度组合。配制质量浓度分别为 0、0. 1 μg /mL、1 μg /mL、5 μg /mL、10 μg /mL、50 μg /mL、100 μg /mL 的多环芳 烃标准溶液，按 1. 2. 3 的液相色谱条件，对 5 种多环 芳烃的一系列标准溶液进样 20 μL 进行测定。以峰 面积( S) 对化合物质量浓度( ρ) 求得线性回归方程， 计算相关性；

1) 试验表明，建立的芳香烃受体介导的类酶联 免疫分析法的检出限、准确度和重复性均符合标准。 因此本文所建立的类酶联免疫方法具有可行性，适 用于多环芳烃类物质的检测。

2) 与 HPLC 和 GC /MS 法比较后发现，类 ELISA 法检测快速、便捷，可以同时检测多个样品，且成本 较低; GC /MS 法重复性性好，定量准确，但类 ELISA 的检出限较低，灵敏度更好。

3) 在日常检测工作中，可根据样品量和检测需 求等选择检验方法，当样品量较大时可先用 ELISA 法初筛样品中是否含有多环芳烃，如需检测某种多 环芳烃的含量则使用 GC /MS 检测定量。