涡旋混合器在中新型安息药的研讨中的应用

目前在国内外报道中，对苯二氮卓类安眠药如 氯硝西泮和非苯二氮卓类如唑吡坦、佐匹克隆、扎 来普隆检测的报道不少，但对于地洛西泮、尼美 西泮、氯甲西泮、diclazepam 等新型安眠药的相关 报道很少，而且同时测定上述 10 中安眠药的方法未 见报道。对于上述新型安眠药已有的报道，大多是 气相色谱法（GC）、气质联用法（GC/MS）、高效 液相色谱法（HPLC）等。上述这些检测方法中， HPLC 和 GC 灵敏度低同时都无法对待测样品进行准确的定性。而 GC/MS 和 HPLC，GC 相比，灵敏 度高，同时能对样品进行准确定性定量，但是很多 药物结构相似，无法进行分离，需要对药物进行衍 生化处理，整个过程较繁琐；而 HPLC-MS/MS 灵敏 度高、准确度高、检出限低、可以同时对多种物质 进行定性和定量检测。

Biotage EXPRESS ABN 固相萃取柱 （60mg/3mL）；ABSCIEX QTRAP 6500 液相色谱 质谱联用仪，美国 AB 公司；全自动固相萃取仪（拜泰齐贸易上海有限公司）；5430R 离心机，德国 EPPENDORF 公司；VORTEX-5 涡旋混合器，海门其林贝尔公司；微量移液器，德国 EPPENDORF。 Diclazepam(1.0mg/mL)、氟硝西泮（1.0mg/mL)、7- 氨基氯硝西泮（1.0mg/mL)、唑吡坦（1.0mg/mL)、 尼 美 西 泮（1.0mg/mL)、 扎 来 普 隆（1.0mg/mL)、 佐 匹 克 隆（1.0mg/mL)、 氯 硝 西 泮（1.0mg/mL)、 地洛西泮（100µg/mL)、氯甲西泮（1.0mg/mL) 和 Diazepam-D5（100µg/mL)（均购自上海安谱科学仪 器有限公司）。

精密移取各对照品及内标（Diazepam-D5）适量， 分别以甲醇配制成各对照品浓度均为 10μg/mL 的混 合标准溶液和 0.2μg/mL 的内标工作液。

精密移取全血样品 1mL，加入 50ngDiazepam-D5， 混匀，过固相萃取小柱（ABN 柱），再加入 2mL 水 洗脱，固相萃取小柱尽量吹干后，用1mL甲醇洗脱（除 第一步取血 1mL 外，后续过程由全自动固相萃取仪 完成），取洗脱液 5μL 供 LC-MS/MS 分析。

色谱条件 色谱柱：kinetex 2.6µC18(50m×3.0mm)； 柱温：30℃；流速：0.4mL/min；进样量：5µL；流 动相 A：10mmol/L 甲酸铵水溶液；流动相 B：乙 腈； 梯 度 洗 脱 程 序：0~1min，98% A；1~10min，98%~0%A；10~13min，0% A；13~13.1min，0%~98% A； 13.1~15.5min，98% A。

取空白全血添加混合标准溶液，配制成 100ng/ mL 的添加血。按 1.3 方法进行样品处理，按 1.4 的 色谱和质谱条件进行分析，得到 10 种安眠药及内标 的总离子流图，见图 1，同时选取了部分安眠药的 MRM 图，见图 2。结果表明该方法可将 10 种安眠 药及内标较好的进行分离，药物相互之间不影响测 定。

取空白全血添加混合标准溶液，分别配制成 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、25、50、100、250 和 500ng/mL 的添加血。按 1.3 方法进行样品处理，按 1.4 的色谱和质谱条件进行分析，根据各种安眠药的 保留时间和碎片离子定性，以色谱峰面积进行定量， 以信噪比 S/N≥3 作为检出限，以信噪比 S/N≥10 作 为最低定量限，以各被测物浓度为横坐标，以被测 物与内标峰面积比值为纵坐标，进行加权（W=1/x） 最小二乘法回归运算。

十种安眠药中，氯硝西泮、氟硝西泮、7- 氨基 氯硝西泮都属于第三代镇静安眠药，结构比较相似， 保留时间比较接近，为了能使十种安眠药能够完全 分离，综合分离度、峰形等相关因素，选择梯度洗 脱程序进行方法研究。十种安眠药都含有氮原子，在电喷雾离子源（ESI）电离下氮原子易得到一个质 子，形成 [M+H]+ 离子态。因此由理论分析可知在 ESI+ 离子化模式下进行全扫描比在 ESI- 离子模式 下灵敏度更高，因此采用电喷雾离子源（ESI）正离 子模式。在电喷雾离子源（ESI）电离下氮原子易得到一个质 子，形成 [M+H]+ 离子态。因此由理论分析可知在 ESI+ 离子化模式下进行全扫描比在 ESI- 离子模式 下灵敏度更高，因此采用电喷雾离子源（ESI）正离 子模式。