静音混合器在固本健脑法对老年性痴呆模型分析

老年性痴呆即阿尔茨海默病 ( Alzheimer’s disease， AD) ，目前对该病发病机制的研究，主要有 Aβ 级联损伤、 tau 蛋白异常磷酸化和神经元丢失等几种假说，Aβ 级 联损伤假说认为，Aβ 在脑内的异常沉积引起的一系列神经 毒性反应导致神经细胞功能紊乱和死亡，是 AD 发病的重 要机制之一，因此减少 Aβ 的生成、促进 Aβ 清除已成为 治疗 AD 的主要方向之一。固本健脑法顾护先后天之本， 补脾益肾，健脑醒神，兼化痰瘀，临床运用近 20 年，安全有 效。课题组前期从神经元树突棘、海马脑区 c － fos 基因等方面对该法进行了研究，本文拟从 Aβ 生成机制探讨 固本健脑法对淀粉样前体蛋白( Amyloid precursor protein， APP) 加工及转运过程的影响。

清洁级老年 Wistar 大鼠，12 月龄，雄性，84 只，体质量 ( 450 ± 20) g，实验动物由湖北省疾病预防控制中心提供， 许可证号: SCXK( 鄂) 2015 － 0018。

Morriss 水迷宫( 中国医学科学院药物研究所) ; 脑立体 定位仪( 美国 Stoelting 公司) ; 电泳仪电源( 北京六一仪器 厂，DYY － 7C) ; 垂直电泳槽( 北京六一仪器厂，DYCZ － 24DN) ; 电转仪( 北京六一仪器厂，DYCZ － 40) ; 水平摇床 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS － 1) ; LP115pH 计( 德国 Metter － Toledo GmbH 公司) ; mμLISKANMK3 酶标仪( Thermo) ; 离心机、CPA 电子天平、数显磁力搅拌器、5μL 尖头微量进针器等常规器材由实验室提供。

Aβ1 － 42 ( 美 国 Sigma 公 司，批 号: 107761 － 42 － 2 ) ; TEMED( Amresco，Amresc00761) ; 14 － 120 KD 蛋白 marker ( 北京全式金生物技术有限公司，DM111) ; 10 － 250 KD 蛋 白 marker( fermentas，26619 － 1) ; 0． 45 μmPVDF 膜( Millipore，IPVH00010 ) ; 羊 多 抗 VPS35，85 KD ( abcam， Ab10099) ; 兔单抗 SorLA，270 KD( abcam，Ab190684) ; 兔单 抗 ASPP，100 － 140 KD( Cell signaling，10176 － 2 － AP) ; ECL 底物液( Thermo，NCI5079) ; X 光胶片( 柯达，XBT － 1) ; 显影 定影试剂盒( 天津市汉中摄影材料厂) ; 小鼠单抗 β － actin， 42 KD( BM0627) 、HＲP 标记羊抗小鼠二抗( BA1051) 、HＲP 标记 羊 抗 兔 二 抗 ( BA1051 ) 、HＲP 标记兔抗羊二抗 ( BA1060) 均由武汉博士德生物工程有限公司提供; 大鼠 Aβ1 － 42ELISA 检测试剂盒、磷酸酶抑制剂( S1873) 、PMSF ( ST506) 、ＲIPA 裂解液( P0013B) 、BCA 蛋白浓度测定试剂 盒( P0010) 由碧云天生物技术有限公司提供; 水合氯醛、75% 医用酒精、3% 过氧化氢、青霉素、生理盐水为实验室自备。

固本健脑法方药为: 板桥党参 15 g，枸杞子 15 g，茯苓 15 g，炒酸枣仁 15 g，生山楂 15 g。其中板桥党参为湖北恩 施道地药材，由湖北尊生堂中医馆提供，袁成玉中药师鉴定 为板桥党参; 枸杞子、茯苓、炒酸枣仁、生山楂由湖北中医药 大学国医堂提供。上药各称取 750 g，加 6 倍冷水浸泡 30 min，武火煮沸，文火煎煮 30 min，滤出药液，备用; 二煎加入 2 倍冷水，煎煮 20 min 后滤出，与头煎所得药液混合，浓缩。 得含生药量 2 g /mL 的溶液。 盐酸多奈哌齐片( 商品名安理申，Aricept，Donepezil) : 规格为 5 mg /片，由卫材( 中国) 药业有限公司提供，批号: 国药准字 H20050978。研末，溶于灭菌生理盐水中，磁力搅 拌器搅，配制成浓度为 0． 045 mg /mL 的水溶液。存于 4 ℃ 冰箱，备用。

Wistar 大鼠适应性喂养 7 d 后，随机分为正常组、假手 术组、模型组、固本健脑液高剂量组( 简称固高组) 、固本健 脑液中剂量组( 简称固中组) 、固本健脑液低剂量组( 简称 固低组) 、西药组 7 组，每组 12 只。其中正常组不做处理， 假手术组仅注射生理盐水 2 μL，其余各组行脑立体定位手 术注射 Aβ1 － 42造模，具体造模方法如下: 麻醉，备皮，固定， 于两耳尖连线中点沿正中矢状线做一长约 1． 5 cm 切口，暴 露颅骨，用棉签蘸取 3% 过氧化氢擦拭，暴露前囟，找到 “十”“人”字缝。参照脑立体定位图谱，以“十”字缝交叉点 为零坐标，将针尖于前囟后 4 mm，左右旁开 3 mm 处对准并 标记，钻孔。用微量进样器吸取 2 μL Aβ1 － 42，垂直缓慢进 针 4 mm，慢速注射 5 min，留针 5 min，缓慢退针。缝合，碘 伏消毒，肌注青霉素，皮外涂抹马应龙痔疮膏，保暖待苏醒。 造模 3 d 后，固高组、固中组、固低组、西药组各组按人 与动物体表面积折算法分别按 6． 8、3． 4、1． 7、0． 45 mg / ( kg·d) 灌胃，假手术组、模型组分别灌以等体积生理盐 水，连续灌胃 4 周。

行为学检测结束后，禁食 12 h，称重， 6% 水合氯醛麻醉后断头，迅速于冰盘上取脑，分离海马，装入 2． 5 mL EP 管，标记，放入 － 80 ℃冰箱，备用。

给药结束后，采用 Morris 水迷宫实验 检测大鼠的空间学习记忆能力。实验分为定位航行和空间 探查两部分。向池内注入净水，以高出平台 2 cm 为度，倒 入墨水适量，调试软件，将大鼠面向池壁分别从四个象限固 定位置放入水中，记录大鼠在 90 s 内找到平台的时间( 逃 避潜伏期) ，如未找到，则将其引导至固定平台，停留 10 s， 使大鼠能观察周围环境，结束后将水擦干，保暖。连续训练 6 d，第 7 天进行空间探查实验，即撤去平台后，按原方法将 大鼠都从任一以象限放入水中，记录其第 1 次经过原平台 的时间、90 s 内跨越原平台次数等。

SorlA、VPS35、APP 的表达 取组 织块称重，匀浆。BCA 法蛋白浓度测定。配制分离胶与浓 缩胶，上样，经 10% SDS － PAGE 电泳。湿法转移电泳产 物。封闭液浸泡 PVDF 膜，室温摇床封闭 2 h。TBST 稀释 相应一抗，孵育一抗，4 ℃过夜。37 ℃ 摇床孵二抗 2 h。洗 去多于二抗。将 ECL 试剂中增强液与稳定的过氧化物酶 溶液混匀，滴加于 PVDF 膜上，反应，覆膜，X 光胶片压片后 显影，扫描胶片，用 BandScan 分析胶片灰度值。 2． 2． 4 ELISA 法检测 Aβ1 － 42的表达 于造模后 3 d 且未给 药前与治疗后分别检测 Aβ1 － 42 的含量。用预冷的 PBS 冲 洗组织，祛除残留血液，称重后剪碎，加入组织重量 9 倍的 预冷 PBS，用匀浆器充分匀浆，2500 r/min 离心 10 min，取上 清即组织匀浆液，参考试剂盒说明书检测 Aβ1 － 42的含量。

采用 SPSS 17． 0 统计软件进行分析，实验数据用 x 珋± s 表示，P ＜ 0. 05 提示差异有统计学意义。先对各组实验数 据行正态性检验，再检验方差齐性。若符合正态分布和方 差齐 性，采用单因素方差分析; 不符合则多组比较行 Kruskal － Wallis 秩和检验，组间比较行 Nemenyi － Wilcoxon － Wilcox 秩和检验。

与正常组比较，假手术组逃避潜伏期无明显变化( P ＞ 0. 05) 。与假手术组比较，模型组逃避潜伏期显著延长、穿 越平台次数减少，学习记忆能力下降，差异有显著性( P ＜ 0. 01) ; 经药物干预后，大鼠学习记忆能力有所提升，与模型 组比较，各治疗组逃避潜伏期均明显缩短，穿越平台次数增 加，差异有显著性( P ＜ 0. 05) ; 与西药组比较，固中组逃避 潜伏期缩短，穿越平台次数增加，疗效较西药组佳，差异具 有显著性( P ＜ 0. 05) 。见表 1。

4 讨论

关于 AD 的发病机制，被广泛接受的是 Aβ 级联假说， 这种假说的的核心是淀粉样前体蛋白( APP) 。APP 是一 种 110 – 130kDa 的 I 型跨膜蛋白，主要有 APP695 APP751 和 APP770三种异构体，它们共享一段跨膜的肽段，胞外部分叫 做 Aβ 肽。生理情况下，APP 经非淀粉样途径( Non － amyloidogenic processing) 由 α 内 切 酶( α － secretase) 剪 切 成 sAPPα 和 CTFα，CTFα 再经 γ 内切酶( γ － secretase) 切割成 P3 和 AICD ，具有营养和神经保护作用。若进入淀粉样途 径( Amyloidogenic processing) ，则 经 β 内 切 酶( β － secretase) 剪 切 成 sAPPβ 和 CTFβ，CTFβ 再 经 γ 内 切 酶( γ － secretase) 切割成 Aβ 和 AICD，产生具有神经毒性作用的 Aβ。因此，降低进入淀粉样蛋白途径的 APP，是减少 Aβ 产生的重要方法。分拣蛋白相关受体 1 ( Sorting protein － related receptor with A － type repeats，SorL1，又称 SorLA) 基因位于第 11 号 染色体上( 11q23． 2 － q24． 2) ，它所编码的 SorLA 是一种 250KDa 的蛋白质受体，属于 Vps10p( vacuolar protein sorting defective，Vps) 受体蛋白家族一员。主要功能是在细胞 膜之间和细胞器官之间进行物质转运。Vps10p 蛋白属 于 Ι 型跨膜蛋白，其家族共有五个成员，还包括 sortilin、 SorCS1、SorCS2、SorCS3，他们共同的特征是在细胞膜外的 N 端都有一个 Vps10p 跨膜结构域。SorLA 与家族其他受体 蛋白的区别在拥有自己独特的功能模块，包括与 Vps10p 结 构域顺次连接的六翼 β 螺旋结构( β － propeller) ，表皮生长 因子前体型重复序列( EGF － type repeat) ，III 型纤连蛋白 结构域( Fibronectin － type III domains) 与补体型重复序列 ( Complement － type repeats) 构成的蛋白质相互作用结构域。这种特殊的结构决定了 SorLA 对蛋白质具有分选 功能。SorLA 普遍存在于中枢和周围神经系统的神经元， 常见于大脑皮层的锥体细胞，海马和小脑的浦肯野细胞。