涡旋振荡器使用于酵母微粒体的条件优化

基因重组酵母是一种利用基因重组技术，将外源 目的基因转录至酵母细胞中，使之表达相应蛋白的酵 母。重组人代谢酶酵母能够表达人肝微粒中不同亚 型的 CYP450 酶，与其他表达系统（如大肠埃希菌、 哺乳动物细胞和昆虫细胞等）相比，具有重组酶表 达量和催化活性相对较高、生产周期短以及适合于大 批量制备药物代谢物等优点，因而具有突出优势。 Dragan 等通过重组人 CYP2C9 酵母全细胞反应体 系，制备了双氯芬酸的代谢物，但是不同药物的化学 结构及理化性质各不相同， 因此利用重组人 CYP450 酵母全细胞反应体系进行不同药物代谢途径及代谢 物的筛选仍存在一定困难。

LC-2010AHT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）； 涡旋振荡器 XW-80A（海门市其林贝尔仪器制造有限 公司）；玻璃珠（美国 Biospec 公司，直径为 0.5 mm）； 48 孔板（无锡耐思生物科技有限公司）。

重组人 CYP2C9 酵母、 未转染酵母和 4-羟基双 氯芬酸（纯度≥98.0%）由南京珼瑞斯生物医药科技有 限 公 司 提 供 。 还 原 型 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 （NADPH）再生系统试剂购自汇智泰康生物技术（北 京）有限公司。 Lowry 蛋白浓度测定试剂盒、Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 和 PMSF 购自北京索莱 宝科技有限公司。 双氯芬酸标准品（纯度≥98%）和LHistidine 购自东京化成工业株式会社（TCI）。 Leu Minus media 购自北京泛基诺科技有限公司。 Yeast Extract 和 Tryptone 购自英国 Oxoid 公司。 葡萄糖和 DL二硫苏糖醇（DTT）购自上海阿拉丁生化科技股份有限 公司。 三氟乙酸（分析纯）和二水合 EDTA 二钠购自南 京化学试剂股份有限公司。 蔗糖购自西陇科学股份 有限公司。 琼脂粉购自国药集团化学试剂有限公司。

玻璃珠用浓盐酸浸泡 24 h，滤去浓盐酸，用去离 子水洗涤至中性，在 60℃烘箱中干燥 16 h，于 4℃保 存。 使用前，将预处理后的玻璃珠置于冰上备用。

Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 6.7，L-Histidine 0.02，葡萄糖 20，琼脂粉 20（制备固体培养基时添加）。 使用前，于 115℃灭菌 30 min，葡萄糖配制成 20%溶液单独灭菌。

Yeast Extract 10，Tryptone 20， 葡萄糖 20，琼脂粉 20（制备固体培养基时添加）。 使用 前，于 115℃灭菌 30 min，葡萄糖配制成 20%溶液单 独灭菌。

将甘油中保存的未 转染酵母菌接种至 YPD 固体培养基上， 放置生化培 养箱中培养 3 d（30℃）。 3 d 后取 16 个单颗菌落（直 径≥2 mm）， 转移至含有 1400 ml YPD 培养基的 2 L 三角培养瓶中，培养 3 d（30℃，200 r/min）。 离心称重， 按照菌重与培养基体积比 1∶1 加入 YPD 培养基，于 4℃保存备用。

将甘油中保存 的重组人 CYP2C9 酵母菌接种至 SD-His 固体培养基 上，放置培养箱中培养 5 d（30℃）。5 d 后取 16 个单颗 菌落（直径≥2 mm），转移到含有 200 ml SD-His 液体 培养基的 500 ml 三角培养瓶中，培养 40~48 h（30℃、 200 r/min）。 40~48 h 后将培养基全部转移至 2 L 的三 角培养瓶中， 并加入 1400 ml YPD 培养基， 培养 2 d （30℃、200 r/min）。 离心称重，按照菌重与培养基体积 比 1∶1 加入 SD-His 培养基，于 4℃保存备用。

10%蔗糖，0.1 mol/L pH 7.4 磷 酸 钾 缓 冲 液 ，0.1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA（临用前加入 1 mmol/L PMSF）。

取所培养未转染 酵母菌菌液 5 ml（约含酵母菌 2.5 g），离心除去 YPD培养基，按菌重与缓冲液体积比 1∶1 加入酵母微粒体 缓冲液，涡旋使之充分混悬。将混悬液分装入 2 ml EP 管中，使得每个 EP 管中含有 1 ml 混悬液（约含酵母 菌 0.5 g），并分别加入 0.5 g 玻璃珠，在涡旋振荡器上 涡旋振荡 30 次（每次涡旋振荡 30 s，冰上冷却 60 s）， 离心（1000 g，10 min）取上清，再次离心（5000 g，1 h） 取 上 清 ， 上 清 即 为 未 转 染 酵 母 微 粒 体 混 悬 液。 于-20℃保存。

CYP2C9 酵母微粒体（制备条件为涡 旋振荡 30 次，0.5 g 玻璃珠）反应 0 h 和 1 h 样品及未 转染酵母微粒体反应 0 h 和 1 h 样品的 HPLC 检测结 果色谱图。 双氯芬酸、代谢物 4-羟基双氯芬酸及内标 卡马西平在“1.2.6”项的 HPLC 色谱条件下分离度良 好，保留时间分别为 11.08 min、5.13 min 和 3.74 min。 仅在重组人 CYP2C9 酵母微粒体反应 1 h 的样 品 HPLC 图谱中发现双氯芬酸代谢物 4-羟基双氯芬 酸的色谱峰，而其他样品的 HPLC 图谱中未 出现此峰（图 1A、1C 和 1D）。

CYP2C9 酵母微粒体蛋白 活性的影响 探讨涡旋振荡次数对所制备微粒体蛋白活性的 影响时，玻璃珠的用量为 0.5 g。 随着涡旋振荡次数的 增加，所制备酵母微粒体蛋白含量呈增加趋势，在涡 旋振荡次数为 50 次时， 蛋白含量趋于稳定， 约为 22.49 mg/ml（图 2A）。 代谢物 4-羟基双氯芬酸的生成 量在涡旋振荡次数为 30 次时最大， 为 1.82 μg ，且单位时间单位蛋白所生成的代谢物量也最大， 为 0.10 μg/[（mg/ml）·h]（图 2C），随后都呈下降趋势。

酵母细胞壁厚实，影响胞内外物质的接触，因 此细胞破壁对提高酵母利用率非常重要。 目前常用的 酵母破壁方法有酶解法、超声波破碎法、匀浆破碎 法和玻璃珠破碎法等，其中玻璃珠破碎法具有操 作简单，可以同时处理多个样品，且对酶活力和环境 的损害较小等优点。 Donnell 等比较了玻璃匀浆 器、珠磨机、超声破碎和玻璃珠涡旋振荡等 7 种破碎 荚膜葡萄球菌酵母细胞壁提取锌金属蛋白的方法，结果表明玻璃珠涡旋振荡的方法对提取锌金属蛋白最有利，蛋白变性量最小。 制备重组人代谢酶酵母微粒 体通常也是采用玻璃珠涡旋振荡的方法。 为了保 留较强的蛋白活性，避免微粒体蛋白因长时间涡旋振 荡产热而失活，本研究采用涡旋振荡 30 s，冰上冷却 60 s 的方式，重复多次涡旋振荡。 研究结果显示，所有 不同条件制备的重组人 CYP2C9 酵母微粒体蛋白均 具有一定的活性。