QL-861型涡旋混合仪在三棱入血成分含量分析的使

三棱为黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.的干燥块茎，主要分布于 我国东北、黄河、长江中下游流域，野生资源较 为丰富。三棱味辛、苦，性平，入肝、脾经，具 有破血行气、消积止痛等功能，用于癥瘕痞块， 瘀血经闭，食积胀痛，主要含有黄酮和黄酮苷、 苯丙素苷、甾体及其苷、有机酸等化合物。阿魏 酸具有抗血小板聚集、抗血栓等作用，这与三棱 活血化瘀的传统功效相符，可能为破血活性成分； 黄酮类成分具有较强的抗血小板聚集、抗血栓和 镇痛作用。本研究通过建立三棱药材入血成分 对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和芦丁的含量测定方法，考察三棱药材血中移行成分。

三棱药材购自浙江中医药大学中药饮片厂， 经浙江中医药大学药学院宋捷民教授鉴定为浙江 产三棱，符合中国药典 2015 年版一部相关规定。

SPF 级 SD 大鼠，10 只，♂，体质量 180~200 g， 由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可 证号：SCXK(沪)2014-0001。饲养环境：温度 25~27 ℃，湿度 40%~60%，适度照明，食物充足， 自由饮水。

Agilent 1200 型高效液相色谱仪器 ( 美 国 Agilent) ； Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS205DU 型精密天平 (Mettler Toledo 公司)；2-16PK 型离心机(德国 Sigma 公司)；QL-861 型涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造)；SK5210HP 型超声波清洗仪(上海科 导超声仪器有限公司)；ND100-1 型氮气吹扫仪(杭 州瑞诚仪器有限公司)。 乙腈(色谱纯，批号：AS1122-801)、甲醇(色 谱纯，批号：MS1922-801)购自 Tedia 公司；磷酸(成 都科龙化工试剂厂，分析纯，批号：7664-38-2)； 水为超纯水。对羟基苯甲酸对照品 ( 批号： MKBK3576V；纯度≥99%)、香草酸对照品(批号： 110776-20150；纯度：98%)、阿魏酸对照品(批号： 110773-20161；纯度≥98%)、芦丁对照品(批号： Y23M7N11586；纯度≥98%)、内标物核黄素(批号： JS0925RA14；纯度≥99%)均购自中国食品药品检 定研究院。

传统煎煮法：三棱药材 100 g，加去离子水 800 mL 浸泡 0.5 h 后进行煎煮，煮沸 0.5 h，4 层滤 布滤出药液，再次加水 500 mL 煮沸 0.5 h，滤过， 2 次药液合并，浓缩至 50 mL，制成含生药 2 g·mL1 的三棱水煎液原液，110 ℃高压灭菌 30 min，冰 箱冷冻保存。

取 180~200 g 的 SD 大鼠 10 只，饲养 1 周。 按照生药浓度 2 g·mL1 ，剂量 0.2 mL·kg1 ，计算 大鼠的常规给药剂量；每天灌胃 1 次，连续灌胃 7 d。末次给药前禁食 12 h，第 7 天末次给药后， 于 1，2，4 h 分别从同一只大鼠眼眶静脉丛取血， 收集大鼠血液至离心管中，3 000 r·min1 离心 10 min，收集上层血清，56 ℃灭活 30 min，取出 后无菌过滤，后放入20 ℃冰箱保存，为含药血清。

精密称取对羟基苯甲酸对照品、香草酸对照 品、阿魏酸对照品、芦丁对照品适量，用甲醇水 溶液(1∶1)溶解，配制对照品浓度为 1 mg·mL1 的 混合对照品储备液，涡旋仪充分混匀，超声30 min， 0.22 μm 微孔滤膜过滤，4 ℃保存，检测前稀释成 不同浓度。精密称取内标物核黄素适量，用甲醇水溶液 (1∶1)溶解，配制内标物浓度为 1 mg·mL1 的储备 液，涡旋仪充分混匀，超声 30 min，0.22 μm 微孔 滤膜过滤，4 ℃保存。

按“2.4”项下方法处理大鼠空白血清，按“2.5” 项下色谱条件进行测定，空白血清的 内源性物质与对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和 芦丁对照品及内标物的分离度良好，且没有干扰 物质，内源性物质与各药品及代谢物之间不存在 相互作用，说明方法的专属性良好。血清中对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和芦丁的 回归方程分别为 Y=56 971.00X+282.99(r 2 =0.999 8)， Y=36 756.00X+247.66(r 2 =0.999 7)，Y=50 686.00X+ 89.41(r 2 =0.999 8)，Y=36 349.00X+20.99 (r 2 =0.999 7)， 各成分均在质量浓度 0.000 5~0.25 mg·mL1 内线 性关系良好。按信噪比(S/N)为 3 来计算，对羟基 苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁的最低检测限均 为 0.000 1 mg·mL1 。计算得到各组含药血清样本的精密度 RSD<10%，方法回收率>90%，基质效应考察结果 为 89.45%~95.12%；各组样品稳定性均 RSD<10%， 表明本实验精密度良好，回收率和稳定性均符合 药动学要求。利用所建立的方法，对灌胃给予中药三棱后 所采取的 10 只大鼠血清样品进行含量测定，说明该方法能够简单、准确测定大鼠血浆 中三棱的 4 种有效成分的血药浓度。

本研究采用 HPLC 梯度洗脱同时准确、快速 测定三棱药材入血成分对羟基苯甲酸、香草酸、 阿魏酸和芦丁的含量，分离效果好。色谱条件优化发现，水相加入适量的磷酸可以改善峰形并能 提高分离度，当酸度为 0.1%时待测成分均可分离， 效果较好。本研究为进一步研究三棱药材活性成 分与药效物质基础提供一定的实验参考。



 

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