涡旋混合仪使用于二氢杨梅素复方脂质体的制备

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY），又名蛇葡 萄素，是一种二氢黄酮醇类化合物，DMY 活性比较 广泛，安全性好，具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝、镇咳 祛痰等药理作用。盐酸伊立替康（Irinotecan，CPT-11）是一种水溶 性的抗肿瘤药物，1998 年欧洲和美国 FDA 批准将 CPT-11 联合 5- 氟尿嘧啶（5-FU）/ 醛氢叶酸（LV）方 案作为转移性结直肠癌的一线诊治的方案。

盐酸伊立替康标准品（CAS 编号：136572-09-3， 上海奈启生物科技有限公司）；二氢杨梅素标准品 （CAS 编号：27200-12-0，上海奈启生物科技有限公 司）；盐酸伊立替康（含量≥98%，批号：DA056-2- 151103，上海创诺制药有限公司）；二氢杨梅素（含 量≥98%，批号：D16071901，南京狄尔格医药科技有 限公司）；卵磷脂（名称：S100，上海利宝德生物科技 有限公司）；胆固醇（国药集团化学试剂有限公司）； Sephadex G-50 （Medium，Biotopped 公司）；透析袋 （MW:8000-14400，美国 Sigma 公司）；甲醇（色谱纯， DIKMA 公司）；乙腈（色谱纯，DIKMA 公司）；其他试剂均为分析纯。

旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；UV 9100 紫外可见分光光度计 (北京莱伯泰科仪器有限公司)； 纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-ZS90，马尔文仪器有限公司)；离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波细胞破碎机(宁波新芝生物 科技股份有限公司，Scientz－IID)；数显恒温磁力搅 拌器（金坛市荣华仪器制造有限公司）；数控恒温水浴锅 （上海申胜生物技术有限公司）；pH 计 （DELTA320，梅特勒 - 托利多仪器上海有限公司）； 分析天平（SartoriusBT25S,德国 Sartorius）；玻璃层析 柱（哈尔滨市医用玻璃厂）；电子天平（Sartorius 公 司，德国）;真空干燥箱（DZ-3BCⅡ）；涡旋混合仪（其林贝尔仪器制造公司）；离心机（上海安亭科学仪器 厂）。

用 甲 醇 配 制 CPT-11、 DMY 和辅料（空白脂质体）等溶液，使用紫外分光 光度计在 190~600nm 处进行波长扫描，扫描结果见图1。

由图 1 可知，CPT-11 最大吸收波长在 370nm 处；DMY 在 291nm 处有最大吸收波长，辅料不干扰 2 种主药含量的测定。因此选择 370nm 为 CPT-11 的测定波长，291nm 为 DMY 的测定波长。 2.1.2 CPT-11 标准曲线的绘制 称取 CPT-11 标 准品 2.5mg，放于 25mL 容量瓶中，加甲醇溶解制得 浓度为 100μg·mL-1 的溶液。吸取 0.1、0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mL 置于 10mL 容量瓶，得到一系列浓度梯度，以甲醇为空白对照，在 370nm 下测定 溶液吸光度，吸收度 A 对 CPT-11 浓度 C 线型回归， 其 回 归 方 程 为 ：Y=0.0273X+0.0009（R2 =0.9997）， CPT-11 在 1.0~50μg·mL-1 内线性良好。DMY 回收率实验：量取 0.5mL 空白脂质体溶 液，分别滴加 5、20、30μg·mL-1 的 3 个浓度的 DMY 对照品溶液，加入适量的甲醇破乳，按 2.1.3 项下测 定含量，计算其回收率。结果表明，CPT-11 与 DMY 的低、中、高 3 种浓 度的平均回收率都在 99%-100.06%之间，RSD 都小 于 2%，满足方法学要求。分 别 吸 取 100μg·mL-1 的 CPT-11 标准贮备液 0.3，0.2，0.1mL 上柱，进行洗脱，收集游离药物洗脱液，测定样品 CPT-11 吸光度，根据 CPT-11 标准曲线计算其含量 和柱回收率。同样的方法对 DMY 药物进行洗脱，测 定样品 DMY 吸光度，根据 DMY 标准曲线计算其含 量和柱回收率。

脂质体包封率是重要的评价指标，本文曾尝试 采用超速离心法，根据游离药物与复方脂质体之间 的重力差别，通过高速离心进行分离，但在取出过程中容易产生晃动而造成离心不完全，重现性较差。本 文选用 Sephadex G-50 色谱柱将复方脂质体与游离 药物分离开，根据分子粒径的差异，在柱上的停留时 间不同，达到目的。柱回收率结果表明，葡聚糖凝胶 Sephadex G-50 对 DMY 和 CPT-11 的吸附力很小， 柱回收率较高，可以完全被洗脱下来。通过实验，本文对以下几种制备方法进行筛选： 薄膜超声分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法、硫酸铵 梯度法以及乙醇注入法结合硫酸铵梯度法。分别采 用上述方法制备复方脂质体，根据复方脂质体的外 观形态、包封率、载药量及粒径大小，选用乙醇注入 法结合硫酸铵梯度法制备复方脂质体。

建立了 CPT-11-DMY 复方脂质体中药物含量 的紫外分光光度检测方法，方法简便可靠，同时建立 了复方 脂 质 体 的 包 封 率 的 检 测 方 法 为 Sephadex G-50 色谱柱层析法，该方法结果准确，过程简单易 操作且方法的重现性好。以乙醇注入法结合硫酸铵 梯度法构建复方脂质体，根据 L（9 34 ）正交试验确定 优 化 处 方 ， 复 方 脂 质 体 中 CPT-11 的 包 封 率 为 82.58%、DMY 的包封率 71.45%，粒径为 （123.1± 1.8）nm，PDI 为 0.181，大小均匀，呈正态分布，Zeta 电位为 -24.3mV。透射电镜下观察复方脂质体均为 类球型，分散性良好。通过动态透析法建立复方脂质 体的体外释放动力学方法，选用 PBS-2%Tween-80 溶液为透析介质，复方脂质体在体外释药过程中都 符合药典要求即：2h 释放不超过 30%且 48h 释放超 过 50%。说明复方脂质体具有缓释的作用。



 

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