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QL-902在博来霉素诱导肺纤维化大鼠分析的使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-09-05 11:30【

特发性肺间质纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是指慢性、进行性、原因不明的肺间 质性纤维化病变,其发病率为 10~15 人/10 万人,呈 明显增长趋势,缺乏有效的治疗手段、预后差。 迄今多项研究表明,Wnt/β-catenin 信号通路对组织系 统的生理、病理起着至关重要的作用,包括胚胎形成、 细胞增殖、细胞分化、血管生成及癌症形成等。



1 实验材料

1.1 动物

清洁级雄性 Wistar 大鼠 120 只,体质量(200± 20)g,购自北京维通利华动物公司,动物许可证号 SCXK(京)2016-0006。饲养于北京中医药大学东方 医院实验中心清洁级动物房。



1.2 药物

肺纤方(黄芪 15 g,红景天 15 g,冬虫夏草 3 g, 炙麻黄 6 g,水蛭 5 g,白果 10 g,瓜蒌 20 g,甘遂 2 g, 海蛤壳 30 g),饮片由北京中医药大学东方医院中药 房提供,常规煎制,按每 100 g 体质量给药 1 mL 的 标准制备药液。注射用博来霉素,浙江海正药业股份 有限公司,15 mg/支,批号 16037911;醋酸泼尼松片, 天津力生制药股份有限公司,5 mg/片,批号 1703035。



1.3 主要试剂与仪器

TRNzol 总 RNA 提取试剂,天根生化科技有限公 司,批号 DP405-02;RIPA 总蛋白提取试剂盒,美国 Sigma 公司,批号 Cat No.R0278;PMSF,美国 Sigma 公司,批号 Cat No. PMSF-RO;GAPDH 鼠单抗,天 津锐尔康生物科技有限公司,批号 Cat No.REK0005; 抗 wnt3a 抗体,美国 Thermo 公司,批号 Cat PA5-44946;抗 β-catenin 抗体,美国 CST 公司,批 号 Cat 8480;抗 WIF1 抗体,美国 Abcam 公司,批号 Cat ab155101;ECL,德国 Millipore 公司,批号 Cat No.WBKLS0500。超声粉碎机(浙江三门超声波仪器 厂),全自动显微摄像系统(日本 Olympus 公司),涡 旋振荡仪(型号 QL-902,海门市其林贝尔仪器制造有限公司),离心机(美国 Eppendorf 公司),分光光度计、酶标仪、电泳仪、转膜仪(美国 Thermo 公司), 凝胶成像系统(型号 Tanon 1600,上海天能科技有限 公司),荧光定量 PCR 仪(型号 ABI7500,Applied Biosystems)。



2 实验方法

实验大鼠常规饲养 7 d 后,按随机数字表分为假 手术组、模型组、泼尼松组和肺纤方高、中、低剂量 组,每组 20 只。采用博来霉素气管插管复制肺纤维化模型。 大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠(45 mg/kg 体质量)麻 醉,仰卧位固定于手术台上,经气管插入 18 号大鼠 导管。假手术组一次性气管内注入生理盐水 1 mL/kg 体质量,其余组以 3 mg/kg 注入博来霉素,随即注入 空气 0.3 mL,完毕后立即将大鼠直立、旋转,清醒后 正常摄食饮水。大鼠造模次日开始常规灌胃给药,每日 1 次。按 1 mL/100 g 体质量给药标准配制药液。肺纤方高、中、 低剂量组给药剂量依次为 19.8、9.9、4.95 g/kg 体质量, 分别为成人临床用药的 2、1、0.5 倍,每周称重,根 据体质量调整给药剂量;泼尼松组给予泼尼松药液 4.2 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积生理盐水。 给药至取材前 1 d。取大鼠肺组织 100 mg,裂解,离心,收集上清液, 提取组织总蛋白。待检测蛋白样品上样 10 μg/孔;蛋 白电泳;转膜至 0.45 μm 孔径的 NC 膜,转膜 1 h;封 闭;抗体孵育;洗膜;使用 ECL 发光试剂盒检测肺 组织 wnt3a、β-catenin、WIF1 的蛋白表达。其中 wnt3a 稀释比例为 1∶1000,β-catenin 稀释比例为 1∶1000, WIF1 稀释比例为 1∶2000,GAPDH 稀释比例为 1∶ 10 000。使用 Image J 软件对目的条带行灰度分析, 计算目的蛋白相对表达量(目的蛋白灰度值/ GAPDH 灰度值)。



3 讨论

海门市其林贝尔通过分析得出IPF是慢性,进行性和病因不明的间质性肺疾病,治疗效果欠佳。目前尚无特异性的治疗药物,糖皮质激素主要用于肺纤维化急性加重期;吡非尼酮和尼达尼布已经被批准用于治疗肺纤维化。






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