其林贝尔漩涡混合器用于纳米胶束表面抗体偶联

聚合物胶束（polymeric micelles，PMs）作为载体在靶向治疗领域具有广泛的应用。纳米级聚合物胶 束（简称聚合物纳米胶束）作为载体能够通过被动靶 向、主动靶向及物理化学敏感等方式递送药物至靶 位并控制释药，用于各类疾病的诊断和治疗。

1 材料与方法

1． 1 细胞

肝癌细胞 SNU-423 由山西医科大学山 西省重点实验室传代培养。

1． 2 主 要 试 剂 及 仪 器

RPMI Medium Modified、 DMEM ／ HIGH GLUCOSE 购自美国 HyClone 公司； 胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司； DMPE-PEG-Maleimide、DPPE-PEG-Maleimide、DSPEPEG-Maleimide、DOPE-PEG-Maleimide、DLPE-PEGMaleimide 购自美国阿拉丁工业公司；FITC 标记的 Goat Anti-Rabbit IgG HL、Anti-GOLPH2 antibody 购 自英国 Abcam 公司；VORTEX-5 漩涡混合器购自海 门市其林贝尔仪器制造有限公司；UP-250 超声波细 胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司； FCM 购自美国 BD 公司。

1． 3 空载聚合物纳米胶束的制备

分别精确称取10． 00 mg 的 DMPE-PEG-Maleimide、DPPE-PEG-Maleimide、DSPE-PEG-Maleimide、DOPE-PEG-Maleimide 及 DLPE-PEG-Maleimide，置于 5 mL 离心管中，逐滴 加入 2 mL 无菌的 PBS 溶液，置漩涡混合器上充分 涡旋溶解，静置 5 min；超声 3 次，每次 10 s，静置 5 min；经 0． 22 μm 滤膜过滤，获得 5 种试剂的空载 聚合物纳米胶束。

1． 4 空载聚合物纳米胶束与 Anti-GOLPH2 抗体偶联

无菌环境下，取 5 mL 离心管，分别加入 5 种空载聚合 物纳米胶束，每管中加入 0． 647 mg ／ mL Anti-GOLPH2 抗体，使抗体终浓度分别为 2． 5、5． 0、7． 5 μg ／ mL， 置25 ℃，120 r ／ min 摇床孵育 12 h。

1． 5 SNU-423 细胞膜表面 GOLPH2 抗原表达量的检测

1． 5． 1 细胞分组

取对数生长期的 SNU-423 细胞， 均匀接种于 6 孔板，待细胞长至 80％ ～ 90％时，消化 收集细胞，移入 5 mL 的无菌离心管中，335 × g 离心 5 min；用 2 mL PBS 洗涤 2 次，调整离心管中细胞的 浓度为 1 × 106 个 ／ mL。将细胞分为对照组及实验 组，对照组为 Goat Anti-Rabbit IgG HL 孵育过的细 胞；实验组为经 Anti-GOLPH2 抗体标记 Goat AntiRabbit IgG HL 孵育过的细胞。

1． 5． 2 孵育

Anti-GOLPH2 抗体 将 Anti-GOLPH2 抗体用 PBS 按 1 ∶ 1 000 稀释。仅将实验组 SNU-423 细胞离心，弃上清，收集细胞沉淀，每个离心管中分 别加入 0、2． 5、5． 0 和 7． 5 μg ／ mL Anti-GOLPH2 抗 体，重悬细胞，混匀，室温下避光孵育 2 h；335 × g 离 心 5 min；回收含 Anti-GOLPH2 抗体的上清液，细胞 沉淀用 PBS 洗涤 2 次，335 × g 离心 5 min，收集细 胞沉淀。

1． 5． 3 孵育

FITC 标记的 Goat Anti-Rabbit IgG HL 对照组及实验组细胞沉淀中分别加入 Goat AntiRabbit IgG HL（1 ∶ 500 稀释），室温避光孵育 30 min； 335 × g 离心 5 min；收集上清，留存细胞沉淀用 PBS 洗涤 2 次，再用适量 PBS 重悬。采用 FCM 检测对照 组及实验组 SNU-423 细胞中异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光强度。

1． 6 SNU-423 细胞与偶联有

Anti-GOLPH2 抗体的 空载聚合物纳米胶束共同孵育 用 6 孔 板 培 养 SNU-423 细胞，每孔细胞增殖至 80％时，用 0． 25％ 胰蛋白酶消化，335 × g 离心 5 min，收集细胞，PBS 洗涤 2 次。将 Anti-GOLPH2 抗体用无血清培养基按 1 ∶ 1 000 稀释，取适量抗体稀释液重悬细胞沉淀，置 25 ℃，120 r ／ min 摇床孵育 2 h；335 × g 离心 5 min； 收集上清；留存细胞沉淀经 PBS 洗涤 2 次，用 3 mLPBS 重悬细胞，335 × g 离心 5 min；弃上清，加入偶 联有 Anti-GOLPH2 抗体的空载聚合物纳米胶束培养 液混悬，置 25 ℃，120 r ／ min 摇床孵育 6 h。

2 结 果

SNU-423 细胞膜表面的 GOLPH2 抗原相对表达量 ［实验组（6． 96％）与对照组（5． 73％）的差值］为 1． 23％。与对照组相比，实验组细胞膜表面 GOLPH2 阳性表达率差异无统计学意义（F ＝ 6． 91，P ＞ 0． 05）。 见图 1 和图 2。

各类聚合物纳米 胶束经不同浓度的 AntiGOLPH2 孵育后，其 FITC 荧光强度与 Anti-GOLPH2 浓度呈正相关；在相同的 Anti-GOLPH2 浓度下，各 类聚合物纳 米 胶 束 与 Anti-GOLPH2 的 偶 联 效 率 存 在 明 显 的 差 异。其 中 DLPE-PEG-Maleimide 与 DPPE-PEG-Maleimide、DMPE-PEG-Maleimide、DSPEPEG-Maleimide，差异有统计学意义（F ＝ 6． 72，P ＜ 0． 05）。

3 讨 论

聚合物纳米胶束作为两亲性材料，在水相中能 自组装成核-壳式结构，即疏水性内核和亲水性外壳 组成。其中疏水性内核能够包载难溶性的药物，以 提高其稳定性和生物利用度。而亲水性外壳则 影响着聚合物纳米胶束在体内的稳定性、循环动力 学及体内积累等表征。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有无毒、水溶性好、灵活性高等特性， 被广泛地用于聚合物纳米胶束的亲水段。 在主动靶向载体合成的过程中，可先将配体与 含 PEG 的聚合物纳米材料进行偶联，再连接于其他 类细胞膜的载体上。本研究将 Anti-GOLPH2 antibody 与含 PEG 的聚合物纳米胶束共同孵育，使其彼 此偶联，再使其与 SNU-423 细胞膜进行耦合，通过 FITC 标记抗体特异性的结合 Anti-GOLPH2 antibody， 应用 FCM 可较为灵敏地捕获微量的抗体与 FITC 结 合所发出的荧光。



 

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