小柴胡汤对CFA大鼠踝关节组织影响分析！！！

类风湿关节炎（RA）是一种炎症性疾病，以多关 节性、对称性、侵蚀性关节炎为主要临床表现，其特 点是关节滑膜的慢性炎症，导致关节软骨、骨和关节 周围结构的逐渐破坏，导致残疾。RANKL/RANK/ OPG 信号通路参与 RA 软骨和骨的破坏的基本进程， 调节破骨细胞的分化、成熟乃至凋亡，在 RA 骨破坏 中起到重要作用 。目前仍没有完全有效的药物控制 RA 的临床症状。但是随着免疫学、生物学和细胞 分子学的发展，而加之近年来的比较成熟 RA 动物模 型的相继建立，为研究 RA 的发病机制及其临床的治 疗提供了一定的基础实验数据。类风湿关节炎属于 中医痹病范畴。《素问直解·痹论》中记载：“痹， 闭也，血气凝涩不行也”。引起痹病病因各异，但 病机为气机阻滞，气血运行不畅，与“少阳主骨”功 能失调 ，少阳枢机不利密切相关，可以应用少阳病 代表方剂小柴胡汤治疗。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级健康雌性 Wistar 大鼠（辽宁长生生 物技术有限公司购买，许可证号：SCXK（辽）2015- 001，5 ～ 6 月龄，体质量 180 ～ 220 g，60 只，自由 摄食与饮水，均饲养于辽宁中医药大学实验动物中 心 SPF 级实验室 301 室 [ 实验单位使用许可证编号： SYYK（辽）2013-0009]。实验室温度控制在（22±2）℃， 实验室湿度控制在（45±5）%，自然光照周期。

1.2 药物

中药饮片均一次性购买于辽宁中医药大学 附属医院药局。小柴胡汤处方：柴胡 15 g，黄芩 9 g， 党参 9 g，姜半夏 9 g，炙甘草 9 g，生姜 9 g，大枣 6 g， 煎煮浓缩，4 ℃保存备用。雷公藤多苷片悬液：雷公藤多苷片购于上海复旦复华药业有限公司，批准文号： 国药准字 Z1020415，产品批号：160302，10 mg/ 片， 加入蒸馏水搅拌而成。 按人与大鼠体表面积比换算给 药等效剂量，成人与大鼠的折算系数为 6.3。小柴胡 汤药材总重量 66 g，按 70 kg 成人每日 1 付药，雷公藤 多苷片按说明书正常成人用量 1 mg/kg。

1.3 主要试剂与仪器

牛Ⅱ型胶原（170157）（美 国 Chondrex 公司），完全弗氏佐剂（170126）（美国 Chondrex 公司），甲醇（20130827）（国药集团化学 试剂有限公司），无水乙醇（20131009）（国药集团 化学试剂有限公司），异丙醇（HG/T2892-2010）（天 津博迪化工股份有限公司），DEPC水（57F001100）（北 京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），EnoGeneTM BCA 蛋白浓度测定试剂盒（E1WP201）（南京恩晶生 物科技有限公司），Qiagen RT2 First Strand kit（330401）[德 国凯杰（上海）有限公司 ]，Qiagen RT2 SYBR Green ROX qPCR kit（330522）[ 德国凯杰（上海）有限公 司 ]，Veriti 型梯度 PCR 仪（美国，生命技术公司）， 7500 型实时荧光定量 PCR 仪（美国，生命技术公司）， BSA223S-CW 型电子天平（德国，赛多利斯集团）， Nano2000 型超微量紫外分光光度计（德国，赛默飞世尔有限公司），Stratos型台式多功能冷冻高速离心机（德 国，赛默飞世尔有限公司），MK-20 干式恒温箱（杭 州奥盛仪器有限公司），BL100 型雪花制冰机（上海 比朗仪器有限公司），QYC-2102C 型全温摇床（上海 福玛实验设备有限公司），SHZ-88 型水浴恒温振荡器 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.4 实验分组及造模

大鼠适应性饲养 4 d 后，根据 随机数字表分成正常组 10 只，模型组 50 只，于大鼠 右脚跖趾垫处注射，其中正常组生理盐水 0.2 mL/ 只， 模型组完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原蛋白（等体积冰上 混匀）乳状注射液 0.2 mL/ 只。造模 7 d 后，正常组大 鼠关节无变化，模型组大鼠右足肿胀明显，活动受限， 并见到对侧非注射部位关节肿胀，部分动物出现耳、 尾部出现结节，全部模型造模成功。将成功造模的大 鼠根据体质量分层，根据随机数字表分为5组：模型组、XCHT 低剂量组、XCHT 中剂量组、XCHT 高剂量组、 雷公藤多苷组，实验过程中无大鼠死亡。

1.5 药品干预方案

各组于造模后 7 d 开始灌胃给药， 正常组及模型组均予注射用水，小柴胡汤（Xiao Chai Hu Tang, XCHT）低剂量组（生药含量为 0.198 g/mL）， XCHT 中剂量组（生药含量为 0.396 g/mL），XCHT 高 剂量组（生药含量为 0.792 g/mL），分别取 2 mL/ 次， 灌胃 3 次 /d。连续给药 28 d，之后处死取材。

1.6 取组织蛋白标本

实验结束后取全部实验大鼠去皮 去肉的右后踝关节组织样品投入液氮中，尽量剪碎，放 入圆底的微量离心管，称重，将组织于-80 ℃冻存，备用。

2 结果

由图 1 可见，正常组：大鼠双踝关节周围软组织 无肿胀，无骨质疏松、骨质破坏。模型组：大鼠双踝 关节周围软组织肿胀明显，右踝较重，双踝及跖趾关 节关节间隙不清，部分关节融合。XCHT 低剂量组： 大鼠双踝关节周围软组织肿胀明显，右踝较重，双踝 及跖趾关节关节间隙不清，部分关节融合。XCHT 中剂量组：大鼠双踝关节周围软组织肿胀明显，右踝较 重，双踝及跖趾关节关节间隙不清，部分关节融合。 XCHT 高剂量组：大鼠双踝关节周围软组织肿胀明显， 右踝较重；右踝及跖趾关节关节间隙不清，部分关节 融合，但较中剂量组及低剂量组程度轻；左踝及跖趾 关节关节间隙尚清，关节无融合。雷公藤多苷组：大鼠双踝关节周围软组织肿胀明显，右踝较重；右踝及 跖趾关节关节间隙不清，部分关节融合，但较中剂量 组及低剂量组程度轻，与高剂量组相似；左踝及跖趾 关节关节间隙尚清，关节无融合。

3 讨论

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性 疾病，其特征是关节炎症，最终导致软骨和骨的破坏。病程小于 3 个月的早期 RA 患者的影像学研究 表明，部分患者早在发病几周后可以检测到骨侵蚀改变。有研究表明在达到临床缓解的患者中， 高达 20% ～ 30% 的患者表现出渐进性的关节侵蚀性 破坏。延缓甚至阻止软骨和骨质的破坏为类风湿关节 炎治疗的最终目标之一。参与 RA 软骨和骨的破坏的 基本进程，调节破骨细胞的分化、成熟乃至凋亡的最 重要信号通路之一是 RANKL/RANK/OPG 信号通路。 RANKL，源于滑膜组织，在破骨细胞的活化过程中有 着重要的作用，通过与其膜受体 RANK 结合后促进破 骨细胞的活化来促进软骨和骨质吸收。而 OPG 属于肿 瘤坏死因子受体，是 RANK 的天然诱骗受体，能够竞 争性的结合 RANKL，抑制了 RANKL 与 RANK 的结合， 拮抗了 RANKL 的活化破骨细胞而促进软骨和骨质吸收功能。