大鼠的左氧氟沙星药动学研究-涡旋混合器的使用

左氧氟沙星（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＬＶＦ）是氧氟沙星的 左旋异构体，由日本第一制药株式会社于１９８６年开 发。其抗菌活性约为氧氟沙星的两倍，主要作用机 制为抑制细菌 ＤＮＡ 回旋酶（细菌拓扑异构酶Ⅱ）的 活性及抑制 ＲＮＡ 和 蛋 白 质 的 合 成，从 而 阻 止 细 菌 ＤＮＡ 的合成和复制而导致细菌死亡。该 药 具 有 抗菌谱广，抗 菌 作 用 强 的 特 点，对包括厌氧菌在内 的革兰阳性菌和革兰阴性菌具有高度的抗菌活性， 对军团菌、支原体和衣原体也有良好的抗菌作 用。 因左氧氟沙 星 口 服 吸 收 好、生 物 利 用 度 高、组 织 分 布广且毒副作用小等良好的药 动 学 （ｐｈａｒｍａｃｏｋｉ－ ｎｅｔｉｃｓ，ＰＫ）特征和药效动力学（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ， ＰＤ）性质，已被广泛应用于呼吸系统、泌尿系统等感染，具有良好的应用前景。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 药品与试剂

ＬＶＦ 对 照 品（中 国 食 品 药 品 检定 研 究 院，批 号 １３０４５５－２０１１０６，纯 度：９７．１％）； 替 硝 唑 （ＴＮＺ，中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院，批 号 １００３３６－２００７０３，纯度：９９．８％）；肝素（常州千红生化 制药股份有限公司，批号 １３０９０４）；ＬＶＦ片（第一三 共制药有限公司，批号 ＢＭ０４８Ｇ１）；乙腈、甲醇为色 谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸、三乙胺、 磷酸二氢钾为分析纯 （国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司）。

１．１．２ 仪器

ＨＰ－１１００系列高效液相色谱仪（安 捷伦科技有限公司）；ＴＧＬ－１６Ｇ 型高速离心机（上 海安亭科学仪器厂）；ＤＫ－Ｓ２４型电热恒温 水 浴 锅 （上海森信实验有限公司）；ＷＭ－２Ａ 型无油气体压 缩机（天津 市 医 疗 器 械 二 厂）；涡旋混合器VORTEX-5(海门市其林贝尔)、超声波清洗机（天津奥特塞恩斯有限公司）。

１．１．３ 动物与菌株

ＳＰＦ级Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ） 大鼠，雌 雄 各 半，体 质 量 １８０～２２０ｇ，合 格 证 号： ＳＣＸＫ［辽］２０１４－０００１，由中国医科大学 附 属 盛 京 医 院医学实验动物中心提供。 ＰＡ 标准菌株 ＡＴＣＣ２７８５３，由中国医科大学附 属盛京医院检验科提供。

１．２ 方法

１．２．１ 左氧氟沙星分析方法的建立

（１）溶液的 制 备：精 密 称 取 ＬＶＦ 对 照 品 １０．００ ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度， 摇匀，即得质量浓度为１．０００ｍｇ·ｍＬ－１的 ＬＶＦ 储 备液；精密称取 ＴＮＺ１０．００ｍｇ，置于５ｍＬ量瓶中， 加甲醇溶解 并 稀 释 至 刻 度，摇 匀，即得质量浓度为 ２．０００ｍｇ·ｍＬ－１的 ＴＮＺ储备液；精密量取 ＬＶＦ储 备液，分别稀释成质量浓度为２．０００，５．０００，１０．００， ２０．００，５０．００，１００．０，２００．０μｇ·ｍＬ－１的标准系列溶 液，精密吸取 ＴＮＺ标准储备液，稀释成质量浓度为 ２００．０μｇ·ｍＬ－１内标溶液备用。
（２）色谱条件：色谱柱：Ｄｉａｍｏｓｉａｌ－Ｃ１８（１５０ｍｍ× ４．６ｍｍ，５μｍ，北 京 迪 马 公 司）；流 动 相：０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钾（含三乙胺０．３％，用磷酸调至ｐＨ３．０ 左右）－乙 腈（８３∶１７）；流 速：１ｍＬ·ｍｉｎ－１；检 测 波 长： ２９５ｎｍ；柱温：３０℃。
（３）血 浆 样 品 处 理 方 法：取 ０．２ ｍＬ 的 血 浆 样 品，置于１．５ｍＬ 的 ＥＰ管中，加入内标溶液１５μＬ （２００μｇ·ｍＬ－１的 ＴＮＺ甲 醇 溶 液），涡 旋 混 匀，加 入 乙腈６００μＬ，涡旋混匀３０ｓ，于１×１０４ ｒ·ｍｉｎ－１高速 离心５ｍｉｎ，吸取上清液，置 于 新 ＥＰ 管 中，５０ ℃恒 温水浴，上清液以氮气流吹干。残渣加入１００μＬ流 动相溶解，于１×１０４ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，取上清液 ２０μＬ进行 ＨＰＬＣ分析，并记录色谱图。根据血浆 样品的标准曲线 方 程，计 算 血 浆 样 品 中 ＬＶＦ 的 浓度。
（４）肺泡灌洗液样品处理方法：取０．２ｍＬ的肺 泡灌 洗 液（ＢＡＬＦ）样 品，置 于１．５ｍＬ 的 ＥＰ 管 中， 加入内标溶液１０μＬ（２００μｇ·ｍｉｎ－１的 ＴＮＺ甲醇溶 液），其他同“１．２．１（３）”项下方法，进样体积２０μＬ。 根据 ＢＡＬＦ样品的标准曲线方程，计算 ＢＡＬＦ样品 中 ＬＶＦ的浓度。
（５）肺上皮细胞衬液药物浓度的计算：根 据 ＢＡＬＦ中药物浓度和尿素氮 浓 度，按照以下公式计 算肺上皮 衬 液（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌｉｎｉｎｇｆｌｕｉｄ，ＥＬＦ）中 药 物 浓度。 ＥＬＦ药物 浓 度＝ＢＡＬＦ 药 物 浓 度 × 血 浆 尿 素 氮值／ＢＡＬＦ尿素氮值

１．２．２ ＰＡ 慢性肺部感染大鼠模型的建立

依据前期摸索的方法建立PＡ慢性肺部感染大鼠模型。

（１）接种菌液制备：从新鲜过夜培养的 ＰＡ 细菌 平板上挑取完整单菌落置于 ３ ｍＬ 的 ＭＨＢ 肉 汤 中，３７ ℃振荡过夜，获得富集 ＰＡ 菌液，于１．２×１０４ ｒ·ｍｉｎ－１，４ ℃离 心５ｍｉｎ，用 生 理 盐 水 调 整 密 度 至 ０．５麦（约１．５×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１）。取１ｍＬＰＡ 菌 悬液（１．５×１０８ ＣＦＵ·ｍＬ－１）加入９ｍＬ 藻酸盐溶液 （１．１％）中，振荡均匀，用１ｍＬ 注射器 将 混 合 液 缓 慢滴入０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ ＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中，持 续搅拌１ｈ，调节菌液浓度至０．５麦，冰箱冷藏保存 备用。
（２）菌液接 种：大 鼠 腹 腔 注 射１０％水 合 氯 醛（３ ｍＬ·ｋｇ－１）麻 醉，固 定，经口腔气管插管将配 好 的 ＰＡ 藻酸盐包被体悬液０．１ｍＬ注入气管；空白对照 组注入生理盐水包被体悬液。接种后，大鼠继续保 持头仰立位３０ｓ，并左右旋转体位，以确保菌液均匀 分布于两肺。大鼠苏 醒 后，置 于 笼 中 自 由 取 食。大 鼠接种７２ｈ后，每组随机选 取４只 大 鼠，以 一 般 状态结合肺匀 浆 涂 板 及 肺 组 织 病 理 学 检 查，验 证 ＰＡ 慢性肺部感染大鼠模型的成功率。

２ 结果

在 已 建 立 的 色 谱 条 件 下，空 白 血 浆、空白血浆加ＬＶＦ对照品溶液和内标溶液及大鼠 给药后的血 浆 色 谱 图 见 图１。结 果 显 示，本 方 法 特 异性高，ＬＶＦ和内 标（ＴＮＺ）色谱峰峰形良好，保 留 时间分别约为４．２ｍｉｎ和６．３ｍｉｎ，基线平稳，大鼠 血浆中的内 源 性 物 质 不 干 扰 ＬＶＦ 和 内 标 ＴＮＺ 的 测定。取１．５ｍＬ离心管数支，分 别精密加入不同浓度的 ＬＶＦ 对照品溶液后以氮气 流吹干，加入 空 白 血 浆０．２ ｍＬ，旋 涡 混 匀，配 成 含 ＬＶＦ质量浓度分别为０．１００，０．５００，１．０００，２．０００， ５．０００，１０．００，２０．００ μｇ·ｍＬ－１ 的 血 浆 样 品，按 “１．２．１（３）”项 下 操 作，制 备 标 准 曲 线，并 同 时 制 备 空白样品进行 ＨＰＬＣ－ＵＶ 分析，记录色谱图。计算 血浆样品中 ＬＶＦ峰面积Ａｓ 和内标 ＴＮＺ峰面积 Ａｉ 的比值ｆ（ｆ＝Ａｓ／Ａｉ），采用最小二乘法以峰面积比 值ｆ对血药浓度Ｃ 作权重回归计算，得出标准曲线 方程。　血浆中 ＬＶＦ的标准曲线方程为：ｆ＝０．３１６×Ｃ －０．０３１９，ｒ＝０．９９９４。ＢＡＬＦ 中ＬＶＦ的标准曲线 方程为：ｆ＝０．４７５５×Ｃ－０．００１，ｒ＝０．９９９０。结果 显示，血浆中ＬＶＦ在０．１００～２０．００ｍｇ·Ｌ－１范围内线 性关系良好，ＢＡＬＦ中ＬＶＦ在０．０２０～１０．００ｍｇ·Ｌ－１ 范围内线性关系良好。配制ＬＶＦ低、中、高３个浓度 含药血 浆 及 含 药 ＢＡＬＦ 若干份进行稳定性 考 察。 结果表明 ＬＶＦ的血浆样品及 ＢＡＬＦ样品于４ ℃放 置２４ｈ、反复冻融３次及－２０℃冰冻１５ｄ的条件下 均稳定性良好；血浆样品及 ＢＡＬＦ样品经前处理后 的上清液在进样器中放置８ｈ稳定性良好。

３ 讨论

目前，常用的生物样品中ＬＶＦ分析测定的方法 包括微生物法、ＨＰＬＣ－ＵＶ 法和 ＬＣ－ＭＳ法等。采 用 ＨＰＬＣ－ＵＶ 测定 左 氧 氟 沙 星 的 血 药 浓 度 具 有 快 速、准确、重现性好的特点，可通过选择合适的固定 相和流动 相 达 到 最 佳 的 分 离 效 果。本 研 究 建 立 了 ＰＡ 慢性肺部感染大鼠生物样品中的 ＬＶＦ 浓 度 的 ＨＰＬＣ－ＵＶ 测定方法，选择０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢 钾－乙腈（８３∶１７）作 为 流 动 相，并 加 入０．３％三 乙 胺 以改善拖尾问题。因为ＬＶＦ为两性化合物，流动相用磷酸调至ｐＨ３．０左 右，确 保 ＬＶＦ 不 发 生 分 解， 在色 谱 图 中 峰 形 良 好，且 与 内 标 ＴＮＺ 分 离 度 ＞１．５。该方法 回 收 率、准 确 度、精 密 度、线 性 范 围 及检测限均符合生物样品的要求，结果准确可靠。