其林贝尔分析动脉粥样硬化家兔肝脏脂质沉积的

动脉粥样硬化 ( atherosclerosis，AS) 是心脑 血管疾病的重要病理基础，而肝脏脂质沉积是导致 AS 发生的一个重要病理环节，因此改善肝脏脂 质沉积对防治 AS 具有重要意义。化瘀祛痰方为课 题 组 研 制 多 年 的 专 利 方 ( 专 利 号: ZL200710010845. 9) ，对 防 治 AS 具 有 很 好 的 疗 效。前期研究发现，化瘀祛痰方在改善血脂异 常、肝脏脂质沉积方面效果显著。

1 材料及方法

1. 1 动物

健康 SPF 级雄性新西兰白兔 60 只，体质量 ( 2. 2 ± 0. 2) kg，购于济南金丰实验动物有限公司， 实验动物合格证号 SCXK ( 鲁) 2014-0006。动物 饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，SPF 级，温 度 ( 22 ± 2) ℃，湿度 ( 50 ± 6) % 。

1. 2 药物与试剂

化瘀祛痰方由党参 30 g、绞股 蓝 30 g、黄 芪 30 g、茯 苓 15 g、郁 金 15 g、法 半 夏 15 g、丹 参 15 g、川芎 20 g、石菖蒲 20 g 组成，统一由辽宁中 医药大学附属医院实验中心提供并煎煮。辛伐他汀 ( 杭州默沙东制药有限公司，批号 L036325) ; 过硫 酸铵 ( 北京索莱宝科技有限公司，批号 A8090) ;兔 IL-18 Elisa 试剂盒 ( 批号 ml027833) 、兔 IL-1β Elisa 试剂盒 ( 批号 ml027836) ，上海酶联生物科 技 有 限 公 司; BCA 蛋白定量试剂盒 ( 批 号 CW0014S) 、蛋白裂解液 ( 批号 CW2333) 、一抗稀 释液 ( 批号 CW2340S) 、ECL 化学发光试剂 ( 批号 CW0049、CW2340) ，均为康为世纪生物科技有限 公司; 黑素瘤缺乏因子 2 ( AIM2 ) 抗 体 ( 批 号 AＲP50505) 、Caspase-1 抗 体 ( 批 号 AＲP58983 ) 、 gasdermin D 蛋 白 ( GSDMD ) 抗 体 ( 批 号 OACA03071) ，Aviva Systems Biology 公司; 含 NLＲ 家族 Pyrin 域蛋白 3 ( NLＲP3) 抗体 ( Bioss，批号 bs-23723Ｒ ) ; β-actin 抗 体 ( Abbkinet， 批 号 A01010) ; 牛 血 清 白 蛋 白 ( BSA，Sigma，批 号 5329846) ; OCT 包埋剂 ( Sakura，批号 4583) ; 油 红 O 染液 ( 批号 G1016) 、甘油明胶封片剂 ( 批号 G1402) 、苏木素染液 ( 批号 G1004) ，武汉谷歌生 物科技有限公司; 伊红染色液 ( 碧云天生物科技 有限公司，批号 C0109) ; 水合氯醛 ( 上海源液生 物科 技 有 限 公 司，批 号 S24149 ) 、4% 多 聚 甲 醛 ( Solarbio，批号 P1110) 。高脂饲料配方: 1. 5% 胆 固醇、1% 胆盐、3% 猪油、3% 花生油、5% 蛋黄 粉，加 86. 5% 普通饲料，原材料采购于北京索莱 宝科技有限公司，由沈阳于洪前民动物饲料加工中 心制成颗粒。

1. 3 仪器

垂直 电 泳 槽 ( 型 号 1658001 ) 、转 移 电 泳 槽 ( 型号170-3932) 、电泳仪( 型号 PowerPacTM Basic) ， 均为 Bio-Ｒad 公 司 产 品; 多功能全波长酶标仪 ( Molecular Devices，型号 Molecular Devices spectraMax i3) ; 水浴恒温振荡器 ( 其林贝尔仪器制造有限公司，型号 SHZ-88) ; 高速冷冻离心机 ［赛默飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司， 型 号 Thermo ST16Ｒ］; 化学发光成像系统 ( 上海天能科技有限 公司，型 号 Tanon-5200 ) ; 荧 光 显 微 镜 ( 型 号 DM6B) 、组织包埋机 ( 型号 EG 1150H) 、石蜡切 片机 ( 型 号 ＲM2235) 、烘 片 机 ( 型 号 HI1220 ) 、 摊片机 ( 型号 HI1210) ，均为 Leica 公司产品; 干 式恒 温 器 ( 杭州奥盛仪器有限公司，型 号 MK20) ; 冷冻切片机 ( Thermo，型号 Cryotome E) 。

1. 4 动物分组及干预方法

本实验选取对胆固醇饮食敏感 ( 进食高胆固 醇饲料后，短时间形成高胆固醇血症) 的家兔为 研究对象，易于形成 AS 模型，运用高脂饲料喂养 结合免疫损伤方法建立动脉粥样硬化模型。60 只新西兰白兔采用随机数字表法分为空白组、模型组、化瘀祛痰方组及辛伐他汀组，每组 15 只。各 组先给予普通饲料喂养 2 周，随后空白组继续喂养 普通饲料，其他各组改喂高脂饲料同时耳缘静脉一 次性注射牛血清白蛋白 250 mg / kg，以病理形态学 检测发现脂质斑块及血脂异常 ［以总胆固醇 ( TC) 值高于正常组均值的 6 倍视为血脂异常］ 为造模 成功的标准。8 周后采用随机数字表法抽取 2 只 家兔，取主动脉检测斑块形成情况评估造模是否成 功。模型组家兔主动脉内观测到动脉内皮增厚，管 腔变窄，动脉壁内附着大量泡沫细胞及脂质沉积， 脂质条纹明显，说明复制 AS 模型成功，并经耳缘 静脉采集所有家兔血液检测血脂变化情况。造模成 功后化瘀祛痰方组给药剂量 16 g /( kg·d) ，辛伐他 汀组给药剂量 1. 4 mg /( kg·d) ，空白组与模型组 给予 8 ml /( kg·d) 的生理盐水，各组连续灌胃 4 周。

2 结果

空白组家兔肝细 胞索条理清晰排列整齐，肝窦正常，核圆、大、居 中; 模型组肝细胞体积增大，肿胀变圆，胞浆内出 现大量脂肪空泡，脂肪变性明显，肝细胞排列杂 乱; 与模型组相比，化瘀祛痰方组肝细胞的体积大 小有所恢复，细胞肿胀明显减轻，空泡变少，肝细 胞脂肪变性程度减轻; 辛伐他汀组肝细胞排列整 齐，未见显著细胞肿胀，空泡样变明显减轻。空白组家兔肝细胞内无橘 红色脂滴; 模型组胞浆内有大量橘红色脂滴蓄积，脂肪变性明显; 与模型组相比，化瘀祛痰方组和辛 伐他汀组肝细胞内橘红色脂滴均明显减少; 化瘀祛 痰方组与辛伐他汀组间未见显著差异。与空白组比较，模型组肝脏组织及血 清中 IL-18 和 IL-1β 含量均显著升高 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ; 与模型组比较，化瘀祛痰方组及辛伐 他汀组肝脏肌组织及血清 IL-18 和 IL-1β 含量均显 著下降 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。化瘀祛痰方组与 辛伐他汀组间差异无统计学意义 ( P ＞ 0. 05) 。与空白组 比较，模型组肝脏组织 AIM2、Caspase-1、GSDMD 及 NLＲP3 蛋白均显著升高 ( P ＜ 0. 01) ; 与模型组 比较，化瘀祛痰方组及辛伐他汀组肝脏组织 Caspase-1、GSDMD 及 NLＲP3 蛋 白 均 显 著 下 降 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，AIM2 蛋白表达差异无统 计学意义 ( P ＞ 0. 05) 。化瘀祛痰方组与辛伐他汀 组 AIM2、Caspase-1、GSDMD 及NLＲP3蛋白表达差 异无统计学意义 ( P ＞ 0. 05) 。

3 讨论

AS 是一种慢性进展性动脉血管损伤疾病，是 诱发心脑血管疾病的重要病理基础。AS 属中医学 “心悸” “胸痹”等范畴，脾失健运、痰瘀互结是 AS 发生发展的核心病机，治以益气健脾、化 瘀祛痰之法。脾主运化，脾虚津液不得运化转而为痰，阻碍气机，血因气阻日久成瘀，瘀血阻络，津 行受阻聚而为痰，形成痰瘀互结，阻于脉内最终导 致 AS 的发生。临床上应用健脾祛痰化瘀方药治 疗 AS 疾病也取得良好疗效。