脱色摇床使用-小细胞肺癌早期诊断的初步研究

非小细 胞 肺 癌（ＮＳＣＬＣ）是最 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之一，其发病率死亡率均位居恶性肿瘤第一位。 研究表明，可通过检测肺癌患者外周血循环肿瘤细 胞（ＣＴＣ）对肿瘤转移和复发进行早期诊断。本研 究选取了一种基于微流控平台的循环肿瘤细胞分选 仪器，通过对 分 选 出 的 ＣＴＣ 通过免疫化学染色计数，与常规肿瘤标记物进行对比，探讨 ＣＴＣ 检测用 于 ＮＳＣＬＣ早期诊断的可行性。

１ 材料和方法

１．１ 研究对象

观察对象为２０１７年０１年至２０１９年０１月期间 在深圳市人民 医 院 确 诊 为 ＮＳＣＬＣ 的６５例癌 症 患者。入组标准：年 龄１８－８０周岁，性 别 不 限；病 理 诊 断为 ＮＳＣＬＣ患者，所有患者均接受肺部 ＣＴ 扫描， 腹部 Ｂ超，全身骨 ＥＣＴ，头颅 ＭＲＩ及相关实验室检 查以明确分期及远处转移；既往无肿瘤病史；入院前 未接受抗肿瘤的相关治疗。排除标准：临床检验判 定小细胞肺癌或其他恶性肿瘤；合并其他肿瘤患者。 本研究已经过医院医学伦理委员会批准，患者对研 究知情并签署知情同意书。

１．２ 材料和仪器

ＮＣＩ－Ｈ１９７５（非小 细 胞 肺 癌 细 胞 系）购 自 中 国 科学院细 胞 库，活细胞荧光染料 ＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒＣＭＦ－ ＤＡ（货 号：Ｃ７０２５）、细 胞 核 染 料 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（货号：Ｈ１３９９）、磁力架（货号：Ａ３１５４３）购自美国 Ｔｈｅｒ－ ｍｏＦｉｓｈｅｒ公司；低速大容量离心机购自上海安亭科 学仪器厂；垂直混合仪和微型水平脱色摇床购自江苏海门其林贝尔公司；微型台式真空泵购自上海斯 曼峰医疗器械公司；荧光显微镜及单细胞挑取系统 购自 奥 林 巴 斯 （深 圳）工 业 有 限 公 司，ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○Ｒ ＦＸ１循环肿瘤细胞活性分离系统购自新加坡的 Ｃｌｅａｒｂｒｉｄｇｅ生物医学公司，ＣＴＣ鉴定染色过程的细 胞固定液、透化液、封闭液、抗体稀释液、抗体混合液 （含偶联过 氧 化 氢 酶 ｐａｎ－ＣＫ－抗体 和 偶 联 碱 性 磷 酸 酶 ＣＤ４５）、酶显色底物等配套试剂由深圳华大生命 科学研究院提供支持。 采用化学发 光 法 检 测 肿 瘤 标 记 物 ＮＳＥ（货号： ＣＰＯ１１０７０）、ＣＥＡ（货号：ＣＰＯ１１０５０）、Ｃｙｆｒａ２１－１（货 号：ＣＰＯ１１０４０）由深圳市人民医院检验科采 用 上 海 透景生命科技股份有限公司相关试剂盒检测。

１．３ 检测方法

１．３．１ 细胞培养

ＮＣＩ－Ｈ１９７５细胞用含有１０％热 灭火胎牛血清１００ＩＵ／ｍｌ青链霉素的１６４０培养基 培养，培养的细胞用 ＤＰＢＳ 磷酸缓冲液洗涤２次后 用０．２５％胰蛋白酶消化传代或收获细胞。

１．３．２ 细胞掺入与细胞回收率统计

ＮＣＩ－Ｈ１９７５ 细胞培养至融合度约为８０％后用胰酶进行消化，加 入 ＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒＣＭＦＤＡ 染色工作液，于细胞正常生 长条件下孵 育３０ ｍｉｎ。换用新鲜培养基继续培养 ３０ｍｉｎ，将细胞 用 ＰＢＳ漂洗 后，在荧光显微镜下使 用单细胞挑取系统挑取准确数量的细胞，按 照 ５ＣＴＣ／３ ｍｌ、２５ＣＴＣ／３ ｍｌ、５０ＣＴＣ／３ ｍｌ掺 入 全 血 中，每组设３个组内平行。 分别按照ＣＴＣ定量检测试剂盒及ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○Ｒ ＦＸ１ 循环肿瘤细胞活性分离系统说明书进行 ＣＴＣ分离操 作，得到的细胞悬液置于９６孔板中，在荧光显微镜下 进行观察计数。按以下公式进行回收率计算：ＣＴＣ回 收率＝观测ＣＴＣ数量／掺入ＣＴＣ总数×１００％。

１．３．３ ＣＴＣ 的定量检测

每 位 受 试 者 采５ｍｌ血 液样本，用 含 肝 素 钠 的 ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管收 集 后 保 存于４℃冰箱，并且在采集后６ｈ内进行处理。ＣＴＣ 的定量检测按照ＣｌｅａｒＣｅｌｌ○ＲＦＸ１循环肿瘤细胞活性 分离系统说明书进行操作。ＣＴＣ分离后，按照迈新 生物双重免疫化学染色标准步骤进行染色鉴定，在 荧光显微镜明场下进行观察并计数。

１．４ 统计学处理

使用 ＳＰＳＳ２０．０软件 进 行 统 计 分 析，计 数 资 料 采用χ ２ 检验进 行 分 析，以 Ｐ＜０．０５为差 异 有 统 计学意义。

２ 结果

通过 ＣＴＣ 分离回收效率公式计算标记并染色 的 ＮＣＩ－Ｈ１９７５细胞回收效率。实验结果显示，通过 循环肿瘤细胞渗入实验，ＮＣＩ－Ｈ１９７５细胞的回收率 为（８３．３－８６．３）％，平均值为（８５．０±１．５）％（表１）。

为确定经免疫化学染色鉴定后的肿瘤细胞形态 特征，我们先 对 ＮＣＩ－Ｈ１９７５肺癌 细 胞 系、正 常 人 外 周血单核细胞 ＰＢＭＣ进行了染色鉴定，染色后肿瘤 细胞呈现典型的红色，ＰＢＭＣ 染色后呈现典型的蓝 黑色，形态特征见下图１。


３ 讨论

研究表明，循环肿瘤细胞与多种恶性肿瘤的临 床病理分期及预后密切相关，其在远处转移和复发 中的作用也日益受到关注。由于外周血循环肿瘤 细胞水平极低 ，这使得富集分离循环肿瘤细胞挑战 巨大。目前，包括基于细胞物理学特性的方法、基于 磁性亲和选择的分选方法和基于微流体的生物学的 分选方法在内，各种循环肿瘤细胞检测技术发展迅 速，但大多处于研发阶段，从技术平台和临床应用角度仍有巨大发展空间。微流控技术是近些年在循环 肿瘤细胞检测领域新兴的重要技术平台，其利用不 同方法的捕获效率基本在７０％以上。本研究选 取了一种具有高效、不依赖肿瘤细胞表面标志物特 点的基于微流控平台的循环肿瘤细胞分选仪器，其 原理是基于尺寸大小不同的细胞在微流控芯片中表 现出力学特征的不同，从而通过惯性迁移达到分离 的效果。

 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。