大豆肽钙螯合物的制备-QB-9002使用

钙是维持人类生命健康重要的矿物质之一，其 约占成年人体重的 2% ，缺钙会增加人体骨折和患 骨质疏松症的风险，随着全球人口老龄化现象的加 剧，研究新型钙补充剂，以增加人体对钙的吸收利 用率越来越受到人们的关注。另外，钙还具有 参与细胞内代谢、凝血、神经传导、骨骼生长等重 要功能。

1 材料与方法

1． 1 实验材料

低温脱脂豆粕，山东禹王集团; 碱性蛋白酶，诺 维信( 中国) 生物技术有限公司。氢氧化钠、盐酸、 无水氯化钙、无水乙醇、硝酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢 钠，分析纯; 乙腈，HPLC。 K9840 自动凯氏定氮仪，Himac CＲ21 GⅡ型冷 冻离心机，恒温干燥箱，AA － 240 原子吸收分光光 度计( 火焰型) ，D － 2000 Elite 高效液相色谱仪， 835 － 50 型氨基酸自动分析仪，Nano Brook Omni 型 多角度粒度与高灵敏度 Zeta 电位分析仪，尼鲁喷雾 干燥机，制备级高效液相色谱仪，X 射线衍射仪， DSC3 型差示扫描量热仪，TGA2 型热重分析仪。

1． 2 实验方法

1． 2． 1 大豆肽的制备

将低温脱脂豆粕粉碎后，按料液比 1∶ 5 加 85% 乙醇醇洗 60 min，42 ℃干燥后，按料液比 1∶ 9 加入去 离子水，于 pH 4． 5 条件下酸沉 1 h，8 500 r/min 离 心 30 min，沉淀加入 9 倍体积的去离子水充分分散，于 pH 9． 0、60 ℃ 条件下加入 2% 的碱性蛋白酶水解 4 h，调 pH 至中性灭酶，8 500 r/min 离心 30 min，上 清喷雾干燥，即得大豆肽。

1． 2． 2 大豆肽钙螯合物的制备

配制 100 mL 4% 的大 豆 肽 溶 液，调 节 pH 至 7. 8，加入 4 mL 2 mmol /L 的 CaCl2 溶液，于 40 ℃ 恒 温水浴振荡器中反应 1 h，4 000 r/min 离心 10 min， 上清中加入 8 倍体积无水乙醇，静置 30 min，离心， 加入 85% 乙醇洗两次，每次醇洗时间为 30 min，离 心后沉淀于 42 ℃烘干，即得大豆肽钙螯合物。

1． 2． 3 大豆肽钙螯合物在磷酸盐溶液中的稳定性

向 pH 8． 0 的磷酸盐( 10 ～ 200 mmol /L) 缓冲液 ( PBS) 中添加大豆肽钙螯合物，使溶液中钙含量为 1 mg /mL，于 37 ℃下振荡水浴 30 min，离心后，测定 上清中钙含量，计算钙保留率，同时，向溶液中添加 相同含量的 CaCl2作对照。钙保留率按下式计算。 钙保留率 = 离心后上清中钙含量/溶液中钙含 量 × 100%

1． 2． 4 氨基酸组成的测定

采用 OPA FMOC 柱前衍生，通过氨基酸自动分 析仪进行测定。称取约 0． 1 g 大豆肽或大豆肽钙螯 合物于水解管内，加入 8 mL 6 mol /L 的 HCl 溶液， 混匀后放于 110 ℃ 的烘箱内消解 22 h。取出冷却， 将消解液转移到 25 mL 容量瓶中，用 4． 8 mL 10 mol /L 氢氧化钠溶液中和，并用水定容至刻度。采 用双层滤纸过滤，取 1 mL 滤液离心( 10 000 r/min， 10 min) ，取上清液进行测定。

1． 2． 5 大豆肽钙螯合物的脱钙

称取 25 mg 大豆肽钙螯合物，加入 5 mL 0． 2 mol /L 的 pH 8． 0 PBS 中，于微孔板快速振荡器（海门市其林贝尔微孔板快速振荡器QB-9002型）上振荡 5 min，10 000 r/min 离心 10 min，上清液为脱钙后的 大豆肽钙螯合物。该方法可脱除大豆肽钙螯合物中 99% 以上的钙，且大豆肽无损失。

1． 2． 6 大豆肽钙螯合物在不同 pH 条件下的稳定性

将一定量的大豆肽钙螯合物溶解于去离子水 中，使溶液中钙含量为 1 mg /mL，分 别 调 pH 至 2． 0 ～ 8． 0，于 37 ℃ 下振荡水浴 2 h，离心( 10 000 r/min，10 min) ，测定上清的相对分子质量。

1． 2． 7 Zeta 电位分析

参考刘成梅等的方法并加以改进。将大豆 肽或大豆肽钙螯合物配制成 0． 1% 的溶液，调节 pH 至 7． 8，进行 Zeta 电位的测定。

1． 2． 8 XＲD 分析

分别将大豆肽、氯化钙、大豆肽钙螯合物制成粉末，进行 XＲD 分析，扫描角度 5° ～ 90°。 1． 2． 9 DSC 分析 分别称取 3 mg 左右的大豆肽及大豆肽钙螯合 物于坩埚内，置于差示扫描量热仪中，进行热稳定性 分析，同时进行空白对照。温度范围 25 ～ 200 ℃，升 温速度 10 ℃ /min，N2流速 50 mL /min。

1． 2． 10 TGA 分析

分别称取大豆肽及大豆肽钙螯合物 3 mg 于坩 埚中，将坩埚置于热重分析仪中，测定温度 25 ～ 900 ℃，升温速度 10 ℃ /min，N2 流速 30 mL /min，记 录样品质量，计算并绘制质量损失率曲线。 1． 2． 11 数据处理 所有实验数据均通过 IBM SPSS Statistics 25 和 Origin 2018 进行数据处理与作图。

2 结果与讨论

人体摄入的磷元素主要以无机盐形式在肠道被 吸收，浓度约为 20 mmol /L 。为了模拟大豆肽钙 螯合物在人体内的稳定性，并为后续分析大豆肽钙 螯合物的性质提供依据，研究了大豆肽钙螯合物在 不同浓度的 PBS 溶液中的钙保留率。77． 85% 的大豆肽相对分子质量小 于 1 kDa，超过 50% 的大豆肽相对分子质量小于 0． 5 kDa。与大豆肽相比，81． 81% 的螯合肽相对分子质 量小于 1 kDa，有显著提高。而相对分子质量在 1 ～ 3 kDa 的螯合肽占比减少，处于 3 ～ 5 kDa 的螯合肽 则有所增加，表明与钙离子螯合能力较强的大豆肽 相对分子质量主要集中在小于 1 kDa。与螯合肽相 比，大豆肽钙螯合物的相对分子质量则明显向高相 对分子质量范围迁移，如相对分子质量处于 5 ～ 10 kDa 的占比提高了 11． 07 个百分点，处于 3 ～ 5 kDa 的占比提高了 6． 28 个百分点，处于 1 ～ 3 kDa 的占 比提高了 13． 75 个百分点，而小于 1 kDa 的相对分 子质量占比有明显的下降，表明大豆肽钙螯合物具 有更高的相对分子质量。

3 结 论

大豆肽在水解 4 h 条件下，水解度可达 19. 84%， 大豆肽与钙离子进行螯合反应，钙结合量为 53． 03 mg /g，且制备的大豆肽钙螯合物在低浓度磷酸盐存 在时仍具有良好的稳定性，在磷酸盐缓冲液浓度为 10 mmol /L 时，钙保留率为 74． 5%，20 mmol /L 磷酸 盐缓冲液中钙保留率为 62． 17% 。具有较高螯合能 力的大豆肽的相对分子质量主要集中在小于 1 kDa 的范围内。谷氨酸和天冬氨酸是参与大豆肽钙螯合 反应重要的氨基酸。大豆肽钙螯合物在各 pH 条件 下均没有发生明显的解离现象，表明其在不同 pH 条件下均具有较好的稳定性。Zeta 电位分析表明， 大豆肽与钙离子发生反应后，其表面的电负性有显 著的下降。大豆肽钙螯合物在 XＲD 图谱中的衍射 峰有所收窄，且氯化钙的特征峰消失，表明大豆肽与 钙离子形成了新的化合物。对大豆肽及大豆肽钙螯合物的 DSC 分析和 TGA 分析表明，大豆肽与钙离 子发生螯合反应后，生成的大豆肽钙螯合物具有比 大豆肽更好的热稳定性。