睾丸间质细胞甾体激素表达水平-其林贝尔离心机

邻苯二甲酸二( 2-乙基) 己酯( di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP) 又名邻苯二甲酸二异辛酯，属于 邻苯二甲酸酯类( phthalate acid esters，PAEs) 化合 物，是目前使用最广泛的 PAEs 增塑剂。邻苯二甲酸 单 ( 2-乙 基 己 基 ) 酯 ( mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP) 是 DEHP 在哺乳动物肠道内的 主要活性代谢产物。PAEs 塑化剂 DEHP 暴露 所致健康损害已成为我国当前重要的公共卫生问题之一。研究显示，DEHP 及其代谢产物 MEHP 具有 生 殖 发 育 毒 性，是 一 类 环 境 内 分 泌 干 扰 物，但其具体毒作用机制尚未完全阐明。

1 材料与方法

1． 1 细胞

实验细胞来自中科院上海细胞库，为小鼠睾 丸间质瘤细胞( MA-10 mouse leydig tumor cells， mLTC-1 ) 。用含 10% FBS 的 1640 培养液体外培 养，取对数生长期的细胞用于实验。设 DMSO 溶 媒对照组 ( 0μmol /L) 、MEHP 处理组 ( 200、400、 800μmol /L) ，作用 24h，加 hCG 0． 1U/mL 作用 4h 后收集细胞培养液用于检测孕酮; 提取细胞总 ＲNA 用于检测类固醇激素合成关键酶 ( StAＲ/ P450scc /3βHSD) 及 MEF2A 的表达等。

1． 2 主要试剂与仪器

胎牛血清 FBS( Gibco) ，1640 细胞培养液( hyclone) 、青霉素-链霉素溶液( 碧云天) 、PBS ( hyclone) 、DMSO( 国产) 、逆转录试剂盒( TAKAＲA) 、 TＲizol( Invitrogen) 、分子生物学级超纯水( 杭州吉 诺) 、胰酶细胞消化液( 碧云天) ，MEHP ( 纯度为 97%，Sigma) ，人绒毛膜促性腺激素( 国产) 、孕酮 ELISA 试剂盒( 上海易利) 。引物由上海生工合成。ABI step one plus 实时荧光定量 PCＲ 仪( ABI 公司) 、核酸定量仪( Eppendorf 公司) 、全波长酶 标仪( Thermo ) 、台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 ( Eppendorf) 、CO2 培养箱( Galaxy170S) 、倒置相差显微镜 ( 奥特光学) 、PCＲ 板离心机 ( BE-6100，其林贝尔) 、可调式漩涡混匀仪( 赛洛捷克) 、掌上离心机 ( 赛洛捷克) 。

1． 3 CCK8 比色法检测

MEHP 对 mLTC-1 细胞增殖活力的影响 收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，加入 96 孔板，每孔加入100 μL，细胞密度为1 ×103 /孔，其 中边缘孔加入无菌培养液。细胞贴壁后更换为无 血清培养基，孵育 12h 使细胞同步化。随后加入 不同浓度 MEHP，对照组细胞中加入含 DMSO 的 新鲜培养基，培养 24h，各孔加入 10μL 浓度为 CCK8 试剂，在酶标仪上检测波长为 450 nm 的光 密度值( OD450) 。每个浓度重复 6 个孔。

1． 4 ELISA 法检测

MEHP 对孕酮含量的影响 收集细胞培养液，按试剂盒操作说明测量孕 酮含量。在 450nm 检测 OD 值，并根据标准曲线 计算出各组的孕酮浓度。

1． 5 qＲT-PCＲ 检测

StAＲ/P450scc /3βHSD、 MEF2A mＲNA 的表达 应用引物设计软件设计上述基因引物( 如表 1) ，BLAST 验证其有效性，送至生物公司合成，将 提取的细胞 ＲNA 逆转录成 cDNA，qＲT-PCＲ 检测 各组基因表达量。

1． 6 统计学方法

应用 SPSS 20． 0 软件进行统计分析，Prism 6． 0 软件绘制统计图。多组间均数比较采用 ANOVA， 两两比较用 Tukey 法，P ＜ 0． 05 为差异有统计学 意义。

2 结 果

不同浓度 MEHP 染毒 mLTC-1 细胞 24h，结果 显示各组细胞 OD 值与对照组比较没有差异，表 明实验所用 MEHP 浓度不影响细胞增殖活力，有 利于开展相关的功能研究。MEHP 作 用 24h 后，细 胞 培 养 液 中 孕 酮 ( PＲOG) 随 染 毒 剂 量 增 高 呈 下 降 趋 势，其 中 800μmol /L 组与对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0． 01) 。随着 MEHP 染毒剂量的增高，StAＲ mＲNA 逐 渐降低，与对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0． 01，图 3A) 。P450scc mＲNA 和 3βHSD mＲNA 表 达 水 平 在 400μmol /L 和 800μmol /L 组 与 0μmol /L 组比较差异均有统计学意义( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) 。

3 讨 论

PAEs 是一类大量应用于 PVC 塑料工业的塑化 剂，用以增加材料的柔韧性和可塑性。含 PAEs 的 塑料制品在生产和生活中广泛应用，如儿童玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、地板、壁纸、清洁 剂、润滑油、个人护理用品( 如指甲油、头发喷雾剂、 香皂和洗发液) 等产品均含有 PAEs，人体暴露机会 极高。目前的动物体内外实验研究显示，PAEs 是环境内分泌干扰物，DEHP 及其代谢产物 MEHP具有生殖发育毒性、胚胎毒性、免疫毒性、肝肾毒性 及神经毒性等多种毒性。其中生殖发育毒性研究的 最多，睾丸是 DEHP 及 MEHP 的主要靶器官。Leydig 细胞是睾丸内主要的内分泌细胞，其合成分泌的睾 酮对雄性生殖系统的发育非常重要。孕酮是睾酮 合成中非常重要的前体物，其分泌量与睾酮存在密 切的正相关。我们的实验发现，MEHP 暴露 24h 后在 200μmol/L 对实验细胞孕酮分泌影响较小，400μmol/L 以上尤其是800μmol/L 有较明显的抑制孕酮分泌的 作用，与多数研究结果一致，验证了 MEHP 高剂量暴 露抑制雄性甾体激素分泌的观点。



 

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