p38磷酸化蛋白的影响（其林贝尔TS-8S使用）

激 素 性 股 骨 头 缺 血 性 坏 死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由 于糖皮质激素大量使用导致骨内循环障碍、骨代 谢失衡、破骨细胞增多而成骨细胞凋亡，破坏股 骨头局部血运，引起缺血、坏死，继而导致股骨 头塌陷、骨折的一种骨疾病。近年来，由于糖皮 质激素在临床治疗中的滥用，SANFH的发病率日 渐增高，占非创伤性股骨头坏死的首位，起病隐 袭，病情发展较快，致残性强，已成为困扰医患 的重大公共难题之一 。本院院内制剂川骨片对 SANFH有显著临床疗效，但其机制尚不明确。分 裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸 激酶，对细胞的生长、分化、炎症反应等具有调节作用。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

清洁级健康雄性日本大耳兔 56 只，体质量2.0～2.5 kg，由成都中医药大学实验中 心提供（许可证号：川实动管第99011号），检疫合格备用。本研究动物饲养及动物实验均在成都中医药大学实验中心完成，室内保持恒定温度及湿 度，相对湿度为45%～60%。

1. 2 实验药物及制备

川骨片，由续断、骨碎 补、黄芪、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、丹参、菟丝 子、枸杞、补骨脂、杜仲、当归、牛膝、乳香、 没药、红花、独活、威灵仙、白术、茯苓、甘草 等组成，由成都中医药大学附属医院生产，批准 文号：川药制字 Z20070657。仙灵骨葆胶囊（贵州 同济堂制药有限公司，批准文号：国药准字 Z20025337），主要由淫羊藿、续断、丹参、知 母、补骨脂、地黄等组成，研究已证明本品能抑 制破骨细胞的吸收活动，加快骨再建活动，刺激 骨形成，提高骨密度，是临床上用于股骨头坏死 治疗的有效制剂，本实验中作为阳性对照药物进行 研究。将川骨片（规格：0.3 g/片）使用蒸馏水熬制 为水剂，制备为生药量0.6 g/mL混悬液体。将仙灵 骨葆胶囊（规格：0.5 g/粒）用蒸馏水熬制为水剂， 制备为含成药仙灵骨葆胶囊0.6 g/mL 的混悬药液。 药液均于0 ~ 4 ℃保存备用。以上药液制备委托成 都中医药大学附属医院制药车间完成。醋酸泼尼 松龙（华中药业股份有限公司，规格：5 mL∶0.125 g， 生产批号：20171203）。

1. 3 主要试剂与仪器

p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 抗体（美国 CST 公司）； GAPDH（武汉普健生物公司）。BCA蛋白定量检测试剂盒、RIPA lysis buffer （上海碧云天公司）；十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰 胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒（武汉普健生物公 司）； 蛋 白 预 染 marker（美 国 Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系统 （广州明美公司）；PP1152电泳仪（上海CAVOY 公 司）；EPS600C 电转仪（上海天能公司）；TS-8S 脱色摇床（江苏其林贝尔公司）；ChemiDocTM XRS+凝 胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功 能微孔板检测仪（美国PerkinElmer公司）。

1. 4 分组与造模

将56只雄性大耳兔随机分成2 组，即空白组（16只）和造模组（40只）。适应性喂 养1周后，造模组采用贺西京造模法复制SANFH模 型：于兔右侧臀部肌肉注射醋酸泼尼松龙8 mg/kg， 每周2次，连续注射6周。空白组右侧臀肌注射等 量生理盐水，每周2次，连续注射6周。所有动物 左侧臀肌预防性注射青霉素8万U/kg，预防感染， 每周2次，共6周。6周后处死空白组4只和模型组 4 只进行模型鉴定。在无菌条件下取出右侧股骨 头，采用苏木素—伊红（HE）染色，于光镜下观察 骨小梁、骨细胞、髓腔及造血细胞形态、结构和 数量的变化，并在股骨头软骨下区骨组织上随机 选择10个高倍视野，计算每个视野中所有骨陷窝 数和空骨陷窝数，计算出空骨陷窝率，判断造模 是否成功。空骨陷窝率=空骨陷窝数/全部骨陷窝 数 × 100%。

1. 5 给药方法

造模成功后剩余的36只造模组兔 再随机分为模型对照组、川骨片治疗组、仙灵骨 葆胶囊治疗组，每组12只。按成人60 kg体质量换 算法换算，川骨片治疗组给予川骨片（剂量为0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，仙灵骨葆胶囊治疗组给予仙灵骨 葆胶囊（剂量为0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，模型对照组给 予蒸馏水1 mL/kg灌胃，空白组不做任何处理，连 续灌胃42 d。

1. 6 观察指标与方法

1. 6. 1 取材

采用空气栓塞法处死各组家兔，在 无菌条件下取出家兔右侧股骨，取下股骨头冠状 面剖开分别置于 40 g/L 多聚甲醛、液氮中保存备 用。

1. 6. 2 光镜观察股骨头组织形态

将组织放入配 好的混合酸脱钙液中进行脱钙，脱水机内依次梯 度酒精进行脱水，浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，石蜡切片机切片，片厚4 μm，HE染色，树 胶封片供镜检。

1. 6. 3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测股骨头

组织 p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 蛋白表达 将组 织剪碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后进行 离心等处理，用 BCA 试剂盒检测总蛋白含量。 12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白，电转移至PVDF 膜上，一抗（pERK1/2 1∶2 000 稀释，p- JNK 1∶1 000 稀释，pp38 1∶1 000 稀释，GAPDH 1∶5 000 稀释）4 ℃过夜 孵育，室温二抗孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显 影，洗片。胶片经扫描仪扫描后获得图像。用 Image J软件计算目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白 条带的灰度比值（p）。

1. 7 统计方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据 分析，计量资料以均数 ± 标准差（- x ± s）表示，组间 比较用单因素方差分析，股骨空骨陷窝率（p/%）组 间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学 意义。

2 结果

2. 1 家兔股骨头光镜镜检结果

空白组：软骨细 胞以及骨细胞基质红染，染色均匀，软骨细胞排 列规则整齐，组织结构清晰可见，潮线完整。股 骨头部骨小梁完整无明显变形、断裂，排列规 则，骨组织内可见大量活跃的成骨细胞，骨陷窝 稀少，滋养血管丰富，髓腔内可见大量形态规则 的造血细胞，整个组织的结构完整，其中仅可见 极少的脂肪细胞。模型对照组：软骨细胞破坏明 显，细胞变形，不规则，整个软骨层组织排列粗 糙不平整，可见较宽的细胞间隙直达深层组织， 部分动物可见股骨头软骨细胞完全剥离，软骨组 织结构模糊不清，潮线明显中断。骨组织的骨小 梁变细，稀疏，排列不规则，结构紊乱，骨小梁 之间的间距增宽，骨髓内中可见大量分布的脂肪 细胞，而骨细胞则变形萎缩，在组织边缘聚集， 组织内可见大量骨陷窝存在。川骨片治疗组：镜 下可见关节软骨轻度变性，软骨表面细胞排列不 规则，粗糙不整，软骨下骨组织内可见较丰富的 血管分布，骨组织的四层结构基本清晰，潮线不 连续，镜下可见少量炎性细胞增生，骨小梁较模 型对照组粗大，骨髓腔内可见造血细胞散在分布，大部分的骨细胞形态结构正常，骨组织内镜 下可见的空骨陷窝较模型对照组有所减少。仙灵 骨葆胶囊治疗组：镜下可见关节软骨轻度变性， 软骨表面细胞排列不规则，粗糙不整，软骨下骨 组织内可见较丰富的血管分布，骨组织的四层结构基本清晰，潮线不连续，镜下可见少量炎性细 胞增生，骨小梁较模型对照组粗大，骨髓腔内可 见造血细胞散在分布，大部分的骨细胞形态结构 正常，骨组织内镜下可见的空骨陷窝较模型对照 组有所减少。

2. 2 各组家兔股骨空骨陷窝率比较

造模组家兔股骨空骨陷窝率明显高于空白组 （P＜0.05）。表明糖皮质类激素可以导致骨细胞的 破坏，导致空骨陷窝率明显升高。提示实验前期 造模成功。第 13 周时，与模型对 照组比较，川骨片治疗组、仙灵骨葆胶囊治疗组 的空骨陷窝率明显较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；川骨片治疗组空骨陷窝率与仙灵骨葆胶囊 治疗组比较，差异无统计学意义（P > 0.0.5）。

3 讨论

目前，激素性股骨头缺血性坏死（SANFH）的 发病机制仍不明确，存在高凝低纤溶微血管血栓 栓塞学说、脂肪代谢紊乱学说、骨内高压学说、 二次碰撞学说、遗传以及基因多态性学说等 。 但股骨头缺血坏死的发病机制更多集中于分子生 物学水平细胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通 路在促进细胞增殖、分化、抑制其凋亡中发挥重 要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要 成员。活化的 MAPK 通过级联反应将外界信号传 递给细胞核，通过作用于 AIF-2、cMyc 等转录因 子，调节与细胞增殖、分化相关的基因表达。其 中最早发现的Ras-Raf-MAPK经典信号转导途径是 ERK1/2 信号通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4 和ERK5是它的5个亚组，其中ERK1和ERK2是2 个高度同源的亚类，它们的分子质量分别是 44 kDa和42 kDa，它们在增殖过程中起着重要作用， 却在分化过程中作用不明显。Raf家族属于促分 裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），当Raf被 激活，其后使 MEK1/2 磷酸化，最终磷酸化激活 ERK1/2。被激活的ERK1/2转位至核内，引起细胞 生长、增殖与分化。



 

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