人支气管上皮细胞MRP1的影响分析

多 药 耐 药 相 关 蛋 白（Multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1）是一种依赖于 ATP 介导 的底物跨膜转运蛋白，在正常人支气管上皮细胞基 底 外 侧 高 表 达 ， 而 在 慢 性 阻 塞 性 肺 疾 病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）患 者 中 MRP1 表达明显降低。MRP1 能够外排吸入性体外化学异 物、毒物及体内的内源性物质 ，从而在肺组织的 抗氧化应激和解毒方面起重要的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞系

SPF 级 SD 大鼠 30 只，体质 量（220±20 g），雌雄各半，由安徽医科大学实验动物 中心提供，许可证号：SCXK（皖）2017-001，本研究 所涉及的动物实验部分均符合动物伦理委员会的准 则。16HBE 细胞株购自上海子实生物科技有限公司。

1.2 药物及试剂

化痰降气胶囊由白芥子、紫苏子、 白前、金沸草、当归、炙麻黄六味中药组成，每克 含 0.833 g 生药，临床成人每日服用量为 6 g，相当 于生药量的 5 g，安徽中医药大学第一附属医院制剂 中心提供，批号：20170906；高糖培养基（DMEM）， 美国 HyClone 公司，批号：AD19822332；胎牛血 清，美国 Gibco 公司，批号：42G5760K；5-羧基二 乙 酸 荧 光素（5- CFDA），美国 Sigma 公司，批号：BCBT5849；胰 酶 消 化 液 、 BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 、 LTD4 受体拮抗剂（MK571）、CCK8 试剂盒，碧云天 生 物 技 术 研 究 所 ， 批 号 分 别 为 ： 102218181107、 060216160922、 033018180918、 091818190220； 光 谱彩虹预染蛋白 Marker，美国 Fermentas 公司，批 号：00690770；MRP1 抗体、Notch1 抗体、Hes1 抗 体 ， 英 国 Abcam 公 司 ， 批 号 分 别 为 ： ab180960、 ab52627、ab108937；甘油醛-3 磷酸脱氢酶（GAPDH） 抗体、辣根酶标记山羊抗兔 lgG、辣根酶标记山羊抗 小鼠 lgG，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分 别为：OTI2D9，ZB-2301，ZB-2305；ECL 超敏发光 试 剂 盒 ， 美 国 Thermo 公 司 ， 批 号 ： SI257444； DAPT，美国 APE x BIO 公司，批号：208255-80-5。

1.3 仪器

371 型 CO2细胞培养箱、1500 型全波长酶 标仪，美国 Thermo Scientific 公司；超净工作台（YJ1405），苏净集团安泰公司；倒置相差显微镜、荧光 显微镜，日本 Olympus 公司；流式细胞仪，美国 Beckman 公司；蛋白电泳及转膜设备，北京六一生物 科技有限公司；凝胶成像仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.4 含药血清的制备

SD 大鼠 30 只，适应性饲养 1 周后随机分为空白组和给药组。将化痰降气胶囊中 的粉末用生理盐水配成 0.07 g·mL-1 的混悬液，给药 组按照 10 mL·kg- 1 灌胃给药，每天 2 次，连续 7 d。 空白组给予等剂量的生理盐水。末次给药 1 h 后，腹 腔注射 20%乌来糖麻醉（1 g·kg-1 ），腹主动脉取血， 37 ℃静置 1 h 后，3 500 r·min-1 ，离心 10 min；将 相同条件下所采血清混和，56 ℃水浴灭活 30 min，以 除去可能存在的生物活性物质；再用 0.22 μm 的微 孔滤膜过滤除菌，密封后置于-80 ℃冰箱保存备用。 同时以生理盐水制备的正常大鼠血清作对照。

1.5 香烟烟雾提取物（CSE）的制备及实验室前期预实验

将一根去过滤嘴香烟点燃，烟雾 通过注射器连续抽吸与 5 mL 的 DMEM 剧烈摇晃混 合，调整 pH 值至 7.2~7.4，经 0.22 μm 微孔滤膜过 滤除菌，此时 CSE 浓度定为 100%，根据前期预实验 结果，采用 5% CSE 浓度用于后续实验。

1.6 细胞培养、分组及给药方法

将 16HBE 细胞培 养于 DMEM 培养基（含 10%胎牛血清，100 U · mL-1 青霉素和链霉素）中，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中 培养，每 2 d 换液 1 次，4～5 d 细胞生长密度达到 80%左右以 0.25%胰蛋白酶消化、传代。将细胞分为 空白血清组（15%正常大鼠血清）、化痰降气胶囊含药血清低、中、高剂量组（5%、10%、15%含药血清）、 CSE 刺激组（5% CSE+15%正常大鼠血清）、CSE+含 药血清组（5% CSE+15%含药血清）、DAPT 抑制剂组 （50 μmol · L-1 DAPT+15%空白血清）、DAPT 抑制剂 加中药组（50 μmol · L-1 DAPT +15%含药血清）。

2 结果

2.1 化痰降气胶囊含药血清对 16HBE 细胞活力的影响

与正常对照组比较，5% ~ 20%浓度的化痰降气 胶囊含药血清促进细胞增殖，差异有统计学意义 （P < 0.01）。且浓度为 15%时，16HBE 细胞增殖率最 高。故选用 5%、10%、15%为低、中、高浓度用于 后续研究。

2.2 各组 16HBE 细胞中 Notch1、Hes1、MRP1 蛋白表达

比较 利用 Western Blot 技术，以 GAPDH 为内 参，计算各组细胞中 Notch1、Hes1、MRP1 蛋白的相 对表达量。与空白血清组比较，各含 药血清组 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表达均呈浓度依 赖性升高；其中 5%浓度组 Hes1 蛋白表达及 10%、 15%浓度组 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表达均有统计 学意义（P < 0.05，P < 0.01）。15%化痰降气胶囊含 药血清上调 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表达的趋势最 为显著，故在后续实验中均选用此浓度的含药血 清。与空白血清组比较，CSE 刺激组 的 Notch1、MRP1 、Hes1 蛋白表达显著降低（P < 0.01）；与 CSE 刺激组比较，化痰降气胶囊含药血清 干预可逆转 CSE 诱导的蛋白表达下调，差异有统计 学意义（P < 0.05，P < 0.01）。与空白 血清组比较，DAPT 抑制剂组 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表达含量均显著下降（P < 0.05，P < 0.01），15% 含药血清可显著提高 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白的表 达（P < 0.05，P < 0.01）。与单独加入 15%含药血清 组比较，DAPT + 15%含药血清组的 Notch1、Hes1、 MRP1 蛋白表达含量均下调，差异有统计学意义 （P < 0.05，P < 0.01），说明抑制 Notch 通路，有抑制 含药血清上调 MRP1 表达的作用。

3 讨论

慢性阻塞肺病（COPD）是一种可防治的常见疾 病，其特征为持续存在的呼吸道症状和气流受限， 通常由有害颗粒或气体暴露引起的气道和（或）肺泡 异常而导致。目前，COPD 的发病机制尚未完全明 了，主要与肺内氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失 衡、肺部炎性反应及免疫功能紊乱密切相关，往往 是机体内外多种因素相互作用的结果 。MRP1 作 为两性有机阴离子转运载体，在肺组织中发挥重要 的屏障功能，其对吸入性化学异物或毒物、其特异性底物白三烯 C4（LTC4）、及在肺部氧化应激的病理生 理过程中起重要作用的还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化 型谷胱甘肽（GSSG）都起着外排功能 ，还可以调控 反炎症信号以控制嗜中性粒细胞的跨上皮迁移从而 减少过度炎症。



 

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