用其林贝尔脱色摇床对糖尿病肾病小鼠氧化应激

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖 尿病致死率最高的微血管并发症，也是导致终末期 肾病的主要原因。DN 的主要病理特征为肾小球基 底膜增厚、细胞外基质和系膜扩张、肾小球硬化伴 有不同程度的肾间质和肾小管损害。DN 的发病机 制包括肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）激活导致 的血流动力学异常和血流变因素、糖代谢紊乱、糖 基化终产物、各种生长因子及细胞因子、氧化应激 反应、遗传因素等。其中，高血糖导致的氧化应 激起了关键作用。有研究表明，核因子红细胞衍 生 2 相关因子/血红素氧合酶（Nrf2/HO-1）是细胞 内抗氧化应激最重要的通路之一。

1 材料 

1.1 实验动物 

自发型 2 型糖尿病 C57BLKS/Jdb/db 小鼠 （db/db）10 只，雄性，9 周龄，体质量（35.10±1.41） g（33～37 g），同遗传背景的 C57BLKS/Jdb/+小鼠 （db/m）10 只，雄性，9 周龄，体质量（19.84±1.18） g（18～22 g），购自南京大学模式动物研究所，许 可证号 SCXK（苏）2018-0008。本研究已通过南开 大学动物护理与使用委员会批准。 

1.2 药物与试剂 

五味子（天津市中药饮片厂有限公司，批号 1806038-01），经天津市医药科学研究所贾淑杰主任 技师鉴定为木兰科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果实；小鼠尿微量白蛋白 ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；丙 二醛（MDA）检测试剂盒（北京碧云天生物科技有 限公司）；过碘酸雪夫（PAS）染色试剂盒（北京索 莱宝科技有限公司）；反转录试剂盒、PCR 试剂盒 （北京全式金生物技术有限公司）；PCR 引物（北京 六合华大基因科技有限公司）；兔抗 Nrf2 多克隆抗 体、兔抗 HO-1 多克隆抗体、兔抗 β-actin 单克隆抗 体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 二抗（北京 中杉金桥生物技术有限公司）；自行配制 TBST 缓冲 液、5%牛奶封闭液、1×RIPA 蛋白裂解液、5×SDS、 1×Running、1×Transfer。 

1.3 主要仪器 

血糖仪、血糖试纸（罗氏血糖健康医护公司）； 台式高速低温离心机、酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；超微量分光光 度计（上海析谱仪器有限公司）；PCR 仪、琼脂糖 凝胶电泳及成像系统、SDS-PAGE 电泳仪与转膜系 统（美国 Bio-Rad 公司）；电热恒温金属浴（杭州奥 盛仪器有限公司）；恒温水浴锅（天津化工有限公 司）；脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；石蜡切片机（德国 Leica 公司）；CX31 正置显 微镜（日本 Olympus 公司）。

2 方法 

2.1 动物分组 

10 只 C57BLKS/Jdb/db 小鼠和 10 只 db/m 小鼠 在温度（22±2）℃，相对湿度（60±10）%，保持 12 h 光照/12 h 黑暗交替的动物房中进行饲养，并保 证相同自由饮水和常规饲料喂养，每 2 天更换 1 次 垫料。顺应性喂养 1 周后，称体质量并测血糖， C57BLKS/Jdb/+小鼠随机分为对照组和 SE 对照组， C57BLKS/Jdb/db 小鼠随机分为模型组和 SE 治疗 组，每组 5 只。 

2.2 药物制备 

按照 Zhang 等的方法和步骤，用乙醇循环萃 取法制备 SE，五味子 100 g 用 95%乙醇每次加热回流 3 h，共提取 2 次，合并 2 次提取液，静置滤过， 减压回收乙醇浓缩成浸膏，4 ℃保存，实验时稀释 最终得到含生药 1 mg/mL 的 SE（经高效液相色谱 分析，SE 中五味子甲素和五味子乙素的质量分数分 别为 1.38%和 1.46%）。 

2.3 给药方法 

小鼠 10 周龄时开始 ig 给药，SE 对照组与 SE 治疗组给予5 mg/kg的SE（给药前将SE放至室温， 混匀后备用），对照组与模型组 ig 等量双蒸水，每 天 1 次，连续给药 6 周。

3 结果 

3.1 各组小鼠体质量、血糖、24 h 尿微量白蛋白测 

定结果 结果如图 1 所示，在实验 0 周时，与对照组相 比，模型组小鼠体质量、血糖和 24 h 尿微量白蛋白 均显著增高（P＜0.01）；SE 对照组与对照组比较， 体质量、血糖和24 h尿微量白蛋白水平差异不显著； 在 3、6 周时，SE 治疗组的血糖和 24 h 尿微量白蛋 白水平明显低于模型组（P＜0.05、0.01），但 SE 治 疗组与模型组比较，小鼠体质量无明显变化；对照 组与 SE 对照组小鼠体质量亦无明显差异。

3.2 氧化应激指标 

结果如图 2 所示，与对照组相比，模型组的 MDA 显著升高（P＜0.01）；SE 对照组 MDA 水平 与对照组比较差异不显著；与模型组相比，SE 治疗 组的 MDA 水平显著降低（P＜0.01）。

4 讨论 

DN 是在糖尿病病程中出现的以蛋白尿、高血 压、水肿、肾功能不全等肾脏病变为特征的疾病，其早期临床表现为肾小球高滤过率，尿微量白蛋白 排泄率正常，随着病情进展，出现微量白蛋白尿、 甚至大量蛋白尿、肾小球滤过率下降，最终导致肾 功能不可逆损害，形成终末期肾病。

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