其林贝尔静音混合器对桦褐孔菌多糖的提取工艺

非酒精性脂肪肝病 ( nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD) 的主要特征是肝细胞内脂肪的变性以及脂质的贮 积，但同时无过量饮酒史的临床病理综合征。经常伴有中 心性的肥胖、高血脂症，对胰岛素的抵抗能以力及对糖的耐量 异常等方面代谢综合征，严重危害人类的健康。近年来， 对 NAFLD 的研究很多，但对其发病机制的研究尚不清楚。因 此，寻找到有效治疗 NAFLD 的药物非常重要。

桦褐孔菌( Phaeoporus obliquus J． Schroet) ，别称白桦茸， 被赞誉为“西伯利亚灵芝”，为真菌门担子菌亚门层菌纲非褐 菌目多孔菌科褐卧孔菌属，是一种非常珍稀而名贵的药用真 菌，生长在温度相对较低的俄罗斯西伯利亚地区的原始森林 中，不能人工栽培，非常稀少，颜色呈深栗色，常在树皮破损及 伤节处形成肉瘤状菌核，菌块性状为近球形或不定形块状; 研 究发现，其化学成分包含多糖类化合物、芳香物质、多酚类化 合物、三萜类化合物等物质，具有重要的药用价值。从 16 世纪至今，桦褐孔菌一直被作为一种民间药物来治疗糖尿 病、高血压、抗衰老等，具有显著的效果。对于非酒精性脂肪肝病的治疗，目前还尚未见相关的研究报道。本试验通 过模拟临床上 NAFLD 的病理特点，通过优化提取桦褐孔菌多 糖提取物，将其作用于 HepG2 细胞，从细胞水平上来评价桦 褐孔菌多糖提取物对细胞脂质堆积的影响，以及对细胞内甘 油三脂含量的影响，从而揭示其在防治非酒精性脂肪肝方面 的药用价值。

桦褐孔菌购于黑龙江省绥芬河市; MTT、TG 试剂盒、油 酸、油红 O 和细胞裂解液购于上海源叶生物科技有限公司; DMEM 细胞培养基、血清、胰蛋白酶等细胞试剂购于 Hylone 公司; 乙醇、异丙醇购于北京化工厂; HepG2 细胞笔者所在实 验室传代保存，由哈尔滨工业大学赠送; 粉碎机( 戴声设备有 限公司) 、超声波清洗机( 杭州法兰特超声波科技有限公司， 总功 率 800 W) 、电 子 天 平 ( QUINTIX224 － 1CN Sartorius， Ｒ210) 、旋转蒸发仪( 瑞士 BUCHI) 、电子显微成像系统( CX31 Olympus) 、酶标仪( Synergy HTX BioTek) 、静音混合器( MT － 360 其林贝尔) 。

将桦褐孔菌粉末过筛，准确称取 5 g 溶于醇浓度为 30% 的乙醇中，在一定时间、温度、料液比和超声波功率下振荡处 理一定 时 间，用 80% 乙醇沉淀多糖后，4 000 r /min，离 心 7 min 后取上清液，减压浓缩至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，标准曲线法测定其含量。

设计桦褐孔菌多糖提取物单因素试验的变量条件分别为: 提取 温度，20、30、40、50、80 ℃ ; 提取时间，10、20、30、40、50 min; 料 液比 1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、 1 g ∶ 25 mL; 超声功率，160、320、400、480、640 W，从而来确定 正交试验中各因素的水平。

在单因素试验基础上，利用 正交试验表 L9 ( 34 ) 进行正交试验，各因素与水平见表 1。

1． 3 细胞培养及 MTT 法测

HepG2 细胞活性 复苏 HepG2 细胞，将实验室冻存的 HepG2 细胞从液氮罐 中取出，迅 速 放 于 37 ℃ 水 浴 锅 中 融 化，用 PBS 清 洗 后， 1 000 r /min 离心去上清后将其放于含 10% FBS 的 DMEM 培 养基中，培养条件: 温度为 37 ℃、体积分数为 5% 的 CO2、饱和 湿度，将培养好的 HepG2 细胞每隔 1 d 进行传代培养，并将取 处于对数生长期的细胞转于 10% FBS 的高糖型 DMEM 培养 基进行下一步试验。 将处于对数生长期的 HepG2 细胞接种于 96 孔细胞培养 板中，并利用细胞计数板记数使每孔细胞的接种量达到 104 个，置于 37 ℃、体积分数为 5% 的 CO2 培养箱中孵育 24 h 后， 设对照组和给药组( 桦褐孔菌多糖提取物) ，给药组的终浓度 分别为 6、60、600、6 000、60 000 mg / L，每组设置 3 个平行孔， 培养 24 h; 每孔加入 5 mg /mL MTT 溶液 10 μL，继续在 37 ℃、 体积分数为 5% 的 CO2 培养箱中培养 4 h; 取出，缓慢吸去培 养液，然后每孔加入 100 μL 的 DMSO，振荡 5 ～ 10 min; 酶标 仪 490 nm 处测吸光度。根据酶标仪的吸光度值计算细胞存活率，选择存活率达到 70% 以上时的桦褐孔菌多糖浓度为安 全浓度。

多糖提取率的影响 通过对比分析分别改变提取时间、超声功率、提取温度、 料液比条件下桦褐孔菌多糖类物质的提取率，结果分别显示， 提取时间为 30 min、超声功率为 320 W、提取温度为 40 ℃、料 液比达到 1 g ∶ 15 mL 时，桦褐孔菌中的多糖提取量最大( 图 1) 。因 此，选 择 提 取 时 间 20 ～ 40 min 、超 声 功 率 240 ～ 400 W、提取温度 30 ～ 50 ℃、料液比 1 g ∶ ( 10 ～ 20) mL 为进一步优化。

通过正交试验确定桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺。正交 试验结果表明，影响桦褐孔菌多糖类物质提取率的因素主次 顺序为 D ＞ A ＞ B ＞ C，即超声功率和超声时间对桦褐孔菌多 糖提取效果影响相对较大，其次为提取温度、料液比的影响。 综合以上条件，桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为 A2B2C1D3， 即按 1 g ∶ 20 mL 的料液比在温度 30 ℃下提取 30 min，超声功 率为 480 W，乙醇浓度为 30% 进行多糖含量测定( 表 2) 。 通过对正交试验结果进行方差分析，来分析各因素对多 糖提取率的影响。结果表明，提取时间、功率、温度和料液比 对提取率影响显著( 表 2) 。

3 讨论与结论

非酒精性脂肪肝病( NAFLD) 的发病率呈现逐年上升的 趋势，已经成为一种严重危害人类健康的世界性疾病。 NAFLD 是导致肝功能异常的主要原因，肝脏脂肪积聚是其典 型特征，但并不能用单一的机制来解释其发病的机制。TG 是 NAFLD 患者肝脏内蓄积的主要脂质，是由体内 TG 合成与转 化失衡的结果。 HepG2 细胞已经被成功用于脂肪肝细胞模型的建立，且 长链脂肪酸能够使 HepG2 细胞内形成明显的脂滴，进而引起 细胞内脂肪的堆积。因为游离脂肪酸中含量最高的是油酸， 所以选择油酸来诱导建立肝细胞脂肪堆积模型，是 符 合 NAFLD 形成的病理生理过程的。因此，本试验采用以上 诱导方法，在单因素的基础上通过正交试验得到桦褐孔菌多 糖的最佳提取条件，将提取的桦褐孔菌多糖提取物作用于 HepG2 细胞，并选择 NAFLD 的常规检测指标来评价桦褐孔 菌多糖对 细 胞 内 脂 肪 堆 积 的 作 用 效 果。试 验 结 果 表 明， 600 mg / L 桦褐孔菌多糖组的效果最显著，TG 含量与模型组 比较 差异极显著( P ＜ 0 ． 0 1 ) ，对细胞内TG的清除率可达24. 57% ，并且具有剂量依赖性。说明桦褐孔菌多糖提取物具 有一定的清除细胞内脂肪堆积的作用，推测其在脂肪肝治疗 方面也具有潜在的药用价值，但目前对于桦褐孔菌多糖降脂 机制还不明确，具体的降脂机制还有待于进一步研究。