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脱色摇床对内皮间质转化的影响中的使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-08-02 14:59【

广义的硬皮病包括由增厚、硬化的皮肤损伤所 引起的一系列异质性疾病,根据是否存在系统受 累,可将其分为局灶性硬皮病和系统性硬皮病( systemic scleroderma,SSc) 。其中 SSc 病因复杂,以 皮肤、内脏纤维化为主要特征,其致病机制主要归结 于自身免疫紊乱、血管损伤与成纤维细胞活化并过 度表达等方面。内皮间质转化是指在各种因素影响 下,内皮细胞向间质细胞转化,获得成纤维细胞特性 的转化过程,内皮间质转化在纤维化、动脉粥样 硬化和肿瘤等疾病的发展中起着重要作用。内 皮间质转化参与 SSc 发病,是 SSc 纤维化过程的重 要始发因素。因此,通过研究寻找能延缓甚至逆 转内皮间质转化发生、发展的有效药物,可能为防治 SSc 提供潜在治疗药物。转化生长因子-β1 ( transforming growth factor-β1,TGF-β1) 是诱导内皮间质 转化发生的关键细胞因子之一。研究表明,在 SSc 的发病机制中,被 THBS、纤维蛋白溶酶等激活后, TGF-β1 可调控复杂的细胞信号反应从而介导 EnMT 过程,导致细胞表达间质细胞抗原。补肾益 精法是邓铁涛教授运用“肺脾肾相关辨治硬皮病” 理论,结合岭南独特的地理环境所拟定的中医特色 治法。本课题组前期研究显示,补肾益精中药复 方在体内外具有抗 SSc 皮肤纤维化的效果,但复 方是否为通过抑制内皮间质转化的机制抗皮肤纤维 化尚不明确。因此,本研究将探讨补肾益精中药复 方对 TGF-β1 诱导的内皮间质转化模型的作用及机 制,为临床早期干预 SSc 提供有力证据。



1 材料与方法

1. 1 实验材料

1. 1. 1 实验动物及细胞


20 只雄性 SD 大鼠,6 ~ 8周龄,体质量( 190 ± 5) g,SPF 级,购于中山大学实验 动物中 心,许 可 证 号: SCXK ( 粤) 2016-0029。HUVEC 购于中山大学实验动物中心细胞库。HUVEC 培养: 培养基为 DMEM-H,10% FBS,1% P /S,pH = 7. 0 ~ 7. 5,于 37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养。



1. 1. 2 实验试剂

黄芪甲苷购于广州市药品检验 所; 0. 25% Trypsin-EDTA( 1X) ( GIBCO 15090-046) 、 PBS pH 7. 4 basic ( 1X) ( GIBCO C10010500BT) 、 TGF-β1( PeproTech,96-AF-100-21C-10) 、Trizol( MRC TR118-500) 、M-MLV Reverse Transcriptase( Promega, M1705) 、GoTaq  qPCR Master Mix ( Promega, A6002) 。



1. 1. 3 实验仪器

电子天平( 上海精密科学仪器, JA1003N) ,基 因 扩 增 仪 ( Hema,Hema9600 ) 、Realtime Quantitative PCR( Bio-Rad,MiniOpticon) ,电泳 仪( TanonEPS 200) ,TS-2000A 脱色摇床( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 TS-2000A ) ,正置光学显 微镜 ( 日 本 尼 康 NIKONECLIPSEE100 ) 、成像系统( 日本尼康 NIKONDS-U3) 。



1. 2 实验方法

1. 2. 1 TGF-β1 诱导


HUVEC 细胞建立内皮间质 转化模型 复苏 HUVEC 细胞株,以 10% FBS 的培 养基,在 37 ℃、5% CO2 条件下培养细胞,细胞消化 传代后,接种 6 孔板,37 ℃、5% CO2 培养箱中过夜, 第 2 天吸去培养基,PBS 洗两遍,每孔加入 1. 5 mL 10 μg·L - 1 TGF-β1 的基础培养基,继续培养 48 h。



1. 2. 2 设计

Fli1 siRNA 序列及细胞转染 设计 Fli1siRNA 序列,吉玛基因进行合成 Fli1 siRNA-1、 Fli1 siRNA-2,然后分别进行细胞转染,48 h 后收集样本进行 QPCR 实验。



1. 2. 3 药物、含药血清的制备

药物制备: 补肾益 精法方药购于广州中医药大学第一附属医院,阿胶 10 g,山萸肉 10 g,熟地黄 20 g,黄芪 30 g,怀山药 30 g,茯苓 15 g,川红花 5 g,加蒸馏水 1 200 mL。浸 泡 20 min 后,沸煮45 min,过滤收集药液。100 ℃水 浴蒸发使药液浓缩至 134 mL ( 相当于含生药量 0. 9 g·mL - 1 ) 。 含药血清的制备: 给药组药量按照 SD 大鼠实 际体质量计算,每 100 g 体质量给予生药量 1. 8 g 的 补肾益精中药复方; 对照血清组按等体积灌胃生理 盐水溶液。每天给药 2 次,连续 3 d。末次给药 3 h 后,严格无菌条件下由心脏 内采血,以 2 500 r·min - 1 离心 15 min,离心半径 12 cm,分离血清, 保存于 - 80 ℃冰箱备用。



1. 2. 4 实验分组及干预

对照血清组: 细胞培养基 中加入 10% 对照血清; 内皮间质转化模型组: 细胞 培养基中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和 10% 对照血 清; 含药血清组: 细胞培养 基 中 加 入 10 μg ·L - 1 TGF-β1 和 10% 含药血清; 黄芪甲苷组: 细胞培养基 中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和 30 μmol·L - 1 黄芪甲 苷; Fli1 siRNA + 含药血清组: 细胞培养基中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和10% 含药血清和200 μmol·L - 1 Fli1 siRNA。均处理 48 h。



1. 3 观察指标及方法

1. 3. 1 显微镜检测


HUVEC 细胞内皮间质转化过 程 10 μg·L - 1 TGF-β1 诱导 HUVEC 细胞 48 h 后, 显微镜下观察细胞形态变化。



1. 3. 2 QPCR法检测

各 组 Fli1、VE-cadherin、 FSP1 的表达情况 6 孔板细胞 PBS 冲洗后加入 1 mL Trizol,吹打后收集到 EP 管内; 离心 15 min,取上 清。组织处理: 取组织于预冷的研钵中,加入液氮研 磨至粉末状,收集到 EP 管内加入 1 mL Trizol,反复 吹打; 离心 15 min,12 000 × g,取上清。向上清液中 加入 200 μL 氯仿,混匀静置 3 min。12 000 × g 离心 15 min 后取上清 500 μL 到新的 EP 管内; 加入等体 积的异丙醇,混匀静置 10 min 后,4 ℃ 12 000 × g 离 心 10 min 后去上清液,加入 1 mL 75% 乙醇,上下颠 倒,使沉淀块重悬起。4 ℃ 12 000 × g 离心 10 min 后去掉上清液。晾干至管壁无液体。加入适量的 DEPC 水溶解 RNA,58 ℃水浴后取出 2 μL 定量,测 量 buffer: 10 mmol·L - 1 TrisCl( pH 7. 8) ,根据定量结果进行逆转录。



1. 4 统计学方法

采用 SPSS 24. 0 统计软件包进 行实验数据分析,计量资料以均数 ± 标准差( x珋± s) 表示,组间比较采用 t 检验。P < 0. 05 为差异有统 计学意义。



2 结果

2. 1 TGF-β1 对 HUVEC 细胞形态的影响


TGFβ1 诱导 HUVEC 细胞 48 h 后,显微镜下观察细胞形 态变化,可见诱导后的细胞呈多角形或梭形,提示内 皮间质转化模型构建成功。见图 1。




2. 2 各组细胞


Fli1、VE-cadherin、FSP1 mRNA 表 达比较 TGF-β1 诱导 HUVEC 细胞后,QPCR 法检 测 Fli1、VE-cadherin、FSP1 的表达,发现模型组内皮 标志物 VE-cadherin 表达降低( P < 0. 01) ,间质标志 FSP1 表达升高( P < 0. 01) ,提示 TGF-β1 诱导内皮 间质转化模型建模成功; 同时模型组 Fli1 表达低于 对照组( P < 0. 05) 。见表 1。





3 讨论


SSc 发病机制主要归结于免疫异常、纤维化与 血管异常三大方面。SSc 常伴不同程度血管损害的 表现,如雷诺现象、指尖溃疡等,且雷诺现象常为本 病首发现象,提示血管损害常出现在早期,是本病发 病的基础环节。研究显示,内皮间质转化参与硬皮病的发生发展。SSc 血管周围微环境可引起血 管内皮细胞的损伤,内皮间质转化,肌成纤维细胞数 量增加,内皮间质转化过程中内皮细胞的生物学 特性显著变化,细胞获得强大的增殖、迁移和收缩能 力。此过程中内皮细胞失去 VE-cadherin 等特异 性内皮细胞标记物,同时获得如 FSP1 间质细胞标 志物。内皮间质转化与多条通路的介导有关,其 中最重要的是 TGF-β 通路。TGF-β1 是早期启动 SSc 组织纤维化的重要因子,可促进多种细胞外基 质的表达。因此,对 TGF-β1 通路的干预已经成为 硬皮病治疗的重要靶点。







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