敷料无菌检查办法的树立

壳聚糖伤口敷料产品含有的壳聚糖，是甲壳素的脱 乙酰产物，是广泛存在于自然界的唯一碱性氨基多糖。 壳聚糖抗菌谱广，具有良好的抗菌特性，对金黄色葡萄 球菌、枯草杆菌、产气荚膜杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃 希菌、白色念珠菌等均有较好的抑制作用 。壳聚糖环境 介质的 pH 越低，所带氨基正电荷越多，抗菌活性也越强。 本研究中根据 2015 年版《中国药典 ( 四部 )》通则 1101 “无菌检查法”建立了壳聚糖伤口敷料的无菌检查方 法，以期为该敷料类医疗器械的检验提供参考。现报道如下。

HF1500TE 型生物安全柜( 上海力申科学仪器有限 公司) ; LＲH － 250F 型生化培养箱、MJ 250FI 型霉菌培 养箱( 上海一恒科学仪器有限公司) ; VOＲTEX － 5 型涡 旋混合器( 江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ; LDZX － 80KCS 型立式压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗 器械厂) 。

壳聚糖伤口敷料( 某生物科技有限公司，批号为 150801，规格为 50 mm × 40 mm) ; 胰酪大豆胨琼脂培养 基( 批号为 1702042) 、沙氏葡萄糖琼脂培养基( 批号为 1704064) 、胰酪大豆胨液体培养基( 批号为 1703102) 、 硫 乙醇 酸盐 流 体培 养 基( 批号 为 160624) 、沙 氏 葡萄 糖液体培养基( 批号为 1505252) ，均购自北京三药科 技 开 发 公 司 ; 氯 化 钠( 批 号 为 20160601) 、氢 氧 化 钠 ( 批 号 为 20160601) ，均 购 自 天 津 市 致 远 化 学 试 剂 有 限公司。

大肠埃希菌( Escherichia coli) [CMCC( B) 44102 ]， 金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) [CMCC( B) 26003]，枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis) [CMCC( B) 63501]，生 孢 梭 菌 ( Clostridium sporogenes) [CMCC( B) 64941]，白 色 念 珠 菌 ( Candida albicans) [CMCC( F) 98001]，黑曲霉( Aspergillus niger) [CMCC( F) 98003]，均 购自中国食品药品检定研究院，工作用菌株为第 3 代。

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌采用胰 酪大豆胨液体培养基，于 30 ～ 35 ℃条件下培养 18 ～ 24 h; 生孢梭菌采用硫乙醇酸盐流体培养基，在 30 ～ 35 ℃ 条件下培养 18 ～ 24 h; 白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液体 培养基，于 20 ～ 25 ℃条件下培养 24 ～ 48 h; 黑曲霉采用 沙氏葡萄糖琼脂培养基，于 20 ～ 25 ℃条件下培养 5 ～ 7 d 后，加入含 0． 05% 聚山梨酯 80 的无菌 0． 9% 氯化钠溶 液，将孢子洗脱。上述 6 株菌株采用 10 倍稀释法制得每 1 mL 含菌数小于 100 cfu 的菌悬液。试验管: 取 20 包样品，无菌操作，每包不同部位剪 取 1 cm × 3 cm，接种于 pH 为 7． 6 的硫乙醇酸盐流体培 养基 300 mL(灭菌前加入适量 1 mol / L 的 NaOH 溶液， 使灭菌后的培养基 pH 为 7． 6 ± 0． 2 )，平行操作 3 次; 取 1 mL 2． 1 项下大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌菌 悬液分别接入其中。另取 20 包样品，无菌操作，每包剪取 1 cm × 3 cm，于 pH 为 7． 6 的胰酪大豆胨液体培养基 200 mL(灭菌前加入适量 1 mol /L 的 NaOH 溶液，使灭菌 后的培养基 pH 为 7． 6 ± 0． 2)中，平行操作 3 次; 取 1 mL 2． 1 项下枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌分别 接入其中。同时测定接种的菌数，吸取制得的大肠埃希 菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液 1 mL，置 90 mm 无菌平皿中，倾注温度不超过 45 ℃融化的胰酪大 豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，于 35 ℃下倒置培养、计数。 量取白色念珠菌和黑曲霉试验菌悬液 1 mL，置 90 mm 无 菌平皿中，倾注温度不超过 45 ℃ 融化的沙氏葡萄糖琼 脂培养基，混匀，凝固，于 25 ℃ 下倒置培养、计数。量 取生孢梭菌试验菌 1 mL，直接接种到 12 mL 硫乙醇酸 盐流体培养管中，于 35 ℃条件下静置培养、计数。

壳聚糖能抑制多种细菌的生长与活性，可能是因为 壳聚糖中含有大量的正电基团，对带有负电荷细菌的电 荷平衡造成破坏，抑制细菌的活性。在 pH 为 7． 6 时，壳 聚糖不再具有抗菌效果，这是由于不带电荷的氨基酸残 基比例的增加及与其更低的可溶性所致。已有文献试验 证明，添加金属离子对壳聚糖抗菌性的影响，如钠离子、 镁离子，浓度越高，壳聚糖抗菌活性越低，这可能与金属 离子能和壳聚糖形成螯合物有关。同时，阴离子表面活 性剂的加入也能使壳聚糖抗菌活性下降，这可能是因为 壳聚糖分子中的带正电的氨基与表面活性剂中的阴离子 结合，降低了抗菌基团的数量，从而降低了抗菌活性。