微型真空泵使用于质谱结合蛋白质组学技术分析

胃癌的发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中位居前列，由于缺乏早期诊断手段，超过 70%的患者确诊 时已有转移或进入中晚期。曲妥珠单抗为靶向 HEＲ-2 的单克隆抗体药物，通过拮抗 HEＲ-2 信号转 导及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用发挥作用，用于 HEＲ-2 过表达转移性乳腺癌和胃癌的治疗。尽 管曲妥珠单抗疗效确切，然而肿瘤获得性耐药已成为影响其有效治疗的重要问题。因此，研究胃癌 曲妥珠单抗耐药机制，对阐明逆转耐药机理，增强肿瘤化疗敏感性具有重要意义。

Q-Exactive Plus 质谱仪和 Easy-nLC 1000 nano 液相色谱仪( 美国 Thermo Fisher 公司) ; VCX500 型 SONICS 多功能超声仪( 美国 Sonics 公司) ; HS-3 垂直混合仪( 宁波新芝生物公司) ; GL-802B 微型真空 泵( 海门其林贝尔仪器公司) ; 5810Ｒ 型真空浓缩仪( 德国 Eppendorf 公司) ; DYY-6C 型电泳仪( 北京六 一仪器公司) ; CKX31 型光学显微镜( 日本 Olympus 公司) ; LＲH-70 生化培养箱( 上海一恒科学仪器 公司) 。 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 细胞由军事医学科学院施明教授惠赠。注射用曲妥珠单抗( 上海罗氏制药 有限公司，规格 440 mg，批号 S20060026) ; 胎牛血清( FBS，美国 Gibco 公司) ; DMEM 培养基和胰酶( 美 国 Mediatech 公司) ; 双抗( 含 100 μg /mL 链霉素和 100 U/mL 青霉素，北京钮英泰克生物技术有限公 司) ; pGEX4T2-catTFＲE 重组质粒( 上海 Sigma 公司合成) ; Biotin 标记的 catTFＲE 引物( 华大基因合成， 引 物 5' 用 biotin 标 记， 正 向 引 物: 5'-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3'， 反 向 引 物: 3'-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5') ; DNA 聚 合 酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder ( 日 本 TakaＲa 公司) ; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒( 北京康为世纪生 物有限公司) ; NE-PEＲ 核蛋白提取试剂盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin 亲和磁珠( 美国 Thermo Fisher 公司) ; 胰酶( 美国 Promega 公司) ; 抗体 c-Jun( 9165) 、JunB ( 3753) 、c-Myc ( 5605) 和 GAPDH ( 5174) ( 美国 Cell Signaling Technology 公司) ; NaHCO3、NaOH( 分析纯，美国 Sigma 公司) ; 甲醇、乙醇、 乙腈、甲酸、纯水( HPLC 级，美国 Thermo Fisher 公司) ; NETN、BC-0、2 ×DNA Binding Buffer、1 ×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE 和 Destain 脱色液(自制) 。

亲代细胞 NCI N87 和耐药细胞 NCI N87 /Ｒ 采用 DMEM ( 加 10% FBS 和 1%双抗) 培 养基，在 5% CO2、37℃培养箱中培养，细胞传代 2～3 次后进行实验。为保持耐药性质，NCI N87 /Ｒ 细胞 培养过程需加入一定量的曲妥珠单抗，终浓度为 40 μg /mL。

pGEX4T2-catTFＲE 的提取 catTFＲE 序列根据高等脊椎动物转录因子库设计 ( http: / /jaspar．genereg．net /) ，将其链接到 pGEX4T2 载体上，得到全长为 2．8 kb 的重组质粒。将 1 μL pGEX4T2-catTFＲE 质粒加入到 50 μL TOP10 感受态细胞中，经热激、复苏后涂布于氨苄抗性 LuriaBertani 平板，37℃ 培养过夜，取单菌落接种于 2 mL Luria-Bertani 培养液，培养 6 h，按 1 ∶ 100 接种至 50 mL 培养基，培养 18 h，按试剂盒说明提取质粒。

2．2．3 Biotin 标记
 

catTFＲE DNA 扩增 引物序列见 2．1 节，PCＲ 反应体系及条件详见文献。DNA 序列见电子版文后支持信息。

catTFＲE DNA 的纯化与回收 catTFＲE DNA 经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带， 使用 DNA 凝胶试剂盒回收、纯化，测定浓度后分装，!20℃保存，备用。

收集对数期生长的细胞，用预冷 PBS 清洗 2 次，重悬，800 r/min 离心 5 min，弃 上清液。利用 NE-PEＲ 试剂盒提取核蛋白，加入 CEＲI 和蛋白酶抑制剂，振荡，冰上裂解 15 min。加入 适量 CEＲII，振荡 10 s，冰上裂解 30 s，4℃、16000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，沉淀加入 NEＲ 重悬，振 荡 20 s，4℃ 垂直混匀仪孵育 1 h。4℃、16000 r/min 离心 20 min，将核蛋白提取物转移于 EP 管中，用 Bradford 法测定蛋白浓度。

pull down 取 DynabeadsTM M-280 Streptavidin 适量于 EP 管中，加入 300 μL1 × DNA 结合缓冲液清洗 M-280，加入计算量的 catTFＲE DNA( 120 μL M-280 结合 3 pmol /LcatTFＲE DNA) ， 再加入等量 2×DNA 结合缓冲液，4℃垂直混匀仪孵育 20 min。用 200 μL BC-200 清洗 M-280，加入核蛋白， 用 BC-0 调整盐浓度至 200 mmol /L，4℃孵育 2 h，分别用 50 mmol /L NETN 和 PBS 清洗 M-280。

样品中加入 20 μL 上样缓冲液，混匀，95℃ 金属浴煮 5 min，取上清液，进 行 SDS-PAGE 电泳，待 Marker 进入分离胶约 2．0 cm 停止电泳，用考马斯亮蓝染色。将胶条自下而上 横切成 6 等份，分别置于 EP 管中，加入 500 μL Destain 脱色液，振荡至完全脱色，加入 200 μL 75%乙 腈，振荡 30 min，吸去脱色液; 加入质谱水 500 μL，振荡水化 1 h，加入 50 mmol /L NH4HCO3 300 μL，振 荡 5 min，吸去上清液，加入 100 ng /μL 胰酶-50 mmol /L NH4HCO3( 1∶ 10，V /V) 溶液，捣碎胶条，37℃孵育 过夜，肽段消化后用 200 μL 乙腈萃取 2 次，合并萃取液，12000 r/min 离心 5 min，加入 30 μL 0．1%甲酸， 振荡 5 min，再加入 200 μL 乙腈，振荡 5 min，合并上清液，60℃真空抽干，质谱检测。

参照文献进行重组质粒 pGEX4T2-catTFＲE DNA 提取与纯化。结果显示，在 2．8 kb 位置可见清 晰且无 干 扰 的 目 的 条 带 ( 图 1) ，与 DL2000 DNA marker 相比，提取质粒浓度≥100 ng /μL，浓度及纯 度均符合实验要求。为检测和定量分析曲妥珠单抗耐药胃癌细胞转 录因子，分别提取 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 细胞核蛋 白，利用液相色谱-质谱结合 catTFＲE pull down 的蛋 白质组学技术对转录因子进行检测和定量分析，采用生物信息学技术分析与 DNA 的结合活性显著变化 的转录因子。

从肽段水平设置 1% FDＲ，共鉴定得到转录因子 359 个。为明确数据分布，对 NCI N87 /Ｒ 和 NCI N87 样本的所有蛋白质的变化倍数( Fold change) 进行总体分析，以 NCI N87 /Ｒ 与 NCI N87 3 次生物学 重复样本中蛋白质峰面积均值之比作为变化倍数，再进行对数转化，发现 90%以上的蛋白质在 NCI N87 /Ｒ/NCI N87 中的变化倍数介于 1．5 倍范围内，不足 10%的蛋白质丰度变化较大( 这些蛋白质具有较 小的 iFOT ( iFOT＜1) ) ，总体数据符合正态分布( 图 4A) 。因此，两组样本的均值满足独立样本 t 检验分 析。根据显著性水平及均值的变化倍数绘制饼图，若某转录因子在 3 次重复实验的均值在两组样本中 的比值大于 1．5，即转录因子与 DNA 结合活性或其表达量变化≥1．5 倍( Fold change≥1．5) 且p＜0．05，则 认为该转录因子在耐药细胞中被激活，其中 Fold change( NCI N87 /Ｒ/NCI N87) ≥1．5 且p＜0．05表示转录 因子与 DNA 的结合活性增强或表达量增加; Fold change( NCI N87 /Ｒ/NCI N87) ≤0．67 且p＜0．05表示与 DNA 的结合活性减弱或表达量降低。

4 结 论

本研究基于液相色谱-高分辨质谱结合 catTFＲE pull down 蛋白质组学技术，检测并定量分析了 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 细胞的转录因子，从转录调控角度分析了转录因子驱动 NCI N87 细胞对曲妥珠单抗 耐药的可能机制，并通过生物信息学手段分析了激活转录因子调控的信号通路，构建了其调控关系，探 究了转录因子-靶基因的调控作用，阐释了 EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活贡献胃癌细胞对曲妥珠单 抗的耐药性，分析了调控 EMT、Wnt 和 MAPK 通路的多个靶基因。本研究为胃癌曲妥珠单抗耐药机制 研究提供了依据，也为逆转其耐药治疗提供了参考。