浅谈银屑病中的调节机制

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，具有治 疗困难、病情易反复等特点，其发病机制尚未明确，大 多认为银屑病的发病是由多因素导致的，包括遗传因 素、感染因素、免疫因素和环境因素等，目前研究发现 线粒体损伤、氧化应激与银屑病的发病有着密切的关 系。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅激活子 1α ( peroxisome proliferator － activated receptor － γ coactivator － 1α，PGC － 1α) 是调节线粒体生物合成的关键因 子，具有调节线粒体呼吸链复合物亚基表达从而减少 ＲOS 生成和调控体内抗氧化因子从而减少氧化应激 的作用。在抗机体氧化损伤中有重要意义。本研究旨 在通过研究银屑病患者外周血单个核细胞( PBMC) PBMC 中 PGC － 1α 的表达从而探讨线粒体障碍对银 屑病的调节机制与凉血消风汤对银屑病的治疗机制。

收集2017 年5 月—2017 年12 月至天津市中医药 研究院附属医院皮肤科就诊血热型寻常型银屑病患 者。血热型诊断标准: 参照《中华人民共和国中医药 行业标准·中医皮肤科病症诊断疗效标准》，主症: 新 皮损不断出现，以丘疹、斑丘疹为主，皮损基底皮肤颜 色鲜红，刮去鳞屑有点状出血，有同形反应。次症: 初 发或复发，可有不同程度的瘙痒、心烦、口渴或口干、便 秘、尿黄、舌质红、苔黄、脉数。具备以上主症及次症 2 项以上者即可诊断。

1. 2 纳入标准及排除标准 纳入标准

①符合寻常型银屑病临床诊断标准，10 ＜ PASI 评分 ＜ 30，处于银屑病进行期;

②符合血热证 诊断标准; ③年龄 10 ～ 70 岁; ④身心健康，无内科严重 心、肝、肾疾病，血尿便常规、肝肾功能及其它生化指标 正常并签署知情同意书。

① 妊娠、哺乳期、 孕妇或 1 年内计划妊娠者;

② 并有严重心、肝、肾疾 患、恶性肿瘤患者; 有严重感染、水电解质及酸碱平衡 紊乱者;

③其他证型银屑病，如血瘀型银屑病、血燥型 银屑病。剔除标准: 纳入后发现不符合纳入标准，或未 按本治疗方案规范实施的病例，需予别除，其结果不计 入最终统计分析。

① 不按时服用药物、复 诊或自行退出;

② 患者病情加重需使用其他药物应急 处理者。

中药组收集 18 例，脱落 4 例。其中男 6 例，女 8 例; 年龄最小 14 岁，最大 63 岁，平均( 37. 64 ± 13. 73) 岁。正常对照组收集 14 例健康人。其中，男 4 例，女 10 例; 年 龄 最 小 21 岁，最 大 65 岁，平 均 ( 40. 71 ± 12. 90) 岁。正常对照组选取年龄、性别与中药组相匹配的健康人来源于本院体检人群，经伦理委员会批准， 所有受试者均签署之情同意书。

Annexin V － FITC /PI apoptosis kit ( 联 科 生 物) ; PPAＲ GCIA antibody ( Sangon Biotech) ; Actin antibody ( Abcam) ; Goat Anti － Ｒabbit IgG，HＲP ( Sangon Biotech) ; ＲIPA 裂解液( 碧云天) ; Western blot 封闭液( BD 脱脂 奶 粉 配 制) ; PVDF 膜 ( Millipore ) ; BSA 缓 冲 液 ( Amresco) ; 30% 丙 烯 酰 胺 ( Amresco ) ; 流 式 细 胞 仪 ( BD) ; 双垂直电泳槽( CAVOY) ; 温控摇床( 其林贝尔) ; 电泳仪( CAVOY) 。

收集约 1 × 106 ～ 3 × 106 个细 胞，加 入 500μL Apoptosis Positive Control Solution 重 悬，置冰上孵育 30min 加入适量预冷 1 × Binding Buffer 重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。 加入预冷 1 × Binding Buffer 补充至 1. 5 mL，等分成 3 管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。单染管分 别加入 5μL Annexin V － FITC 或 10μL PI，流式细胞仪 上，用空白管调节 FSC、SSC 和荧光通道的电压，并在 此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

离心收集 1 ～ 5 × 105 个细胞，用双 蒸水稀释 5 × Binding Buffer 为 1 × Binding Buffer，取 500μL 1 × Binding Buffer 重悬细胞。每管加 入 5μL Annexin V － FITC 和 10μL PI 室温避光孵育 5min。在 流式细胞仪上，通过 FITC 检测通道检测 Annexin V － FITC 和通过 PE 检测通道检测 PI。

①提取细胞总蛋白: 使用酶标仪进 行蛋白定量，根据 SDS － PAGE 上样量需要，取适量样 品加入 4 × loading buffer 后，100℃ 煮沸变性 5min;

② SDS － PAGE 电泳: 根据目的蛋白的分子量，配制 10% 分离胶凝胶，浓缩胶浓度为 4% 。待检测蛋白样品上样量为 10 μL。浓缩胶恒压 80V，约 40 min; 分离胶恒 压 120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部;

③转膜: 采用湿转 法，转膜条件为 300 mA 恒流与 0. 45 μmPVDF 膜。冰 浴转膜时间 2h。转膜完成后用丽春红染色试剂对膜 进行染色，观察转膜效果。设置恒流 300 mA，冰浴转 膜 2 h。

中药组治疗前与正常组 PBMC 凋亡比例用成组 t 检验，结果 P = 0. 014( P ＜ 0. 05，差异有统计学意义) 。 治疗前与治疗后 PBMC 凋亡比例用配对 t 检验，结果 P = 0. 043( P ＜ 0. 05，差异有统计学意义) ，说明银屑病 病人 PBMC 凋亡率高于正常人，经凉血消风汤治疗后 病人凋亡率明显下降，银屑病治疗前 PGC － 1α 蛋白表达较正常组下调， P = 0. 029( P ＜ 0. 05，差异有统计学意义) ，经中药治疗 后 PGC － 1α 蛋白表达较治疗前上调，P = 0. 00 ( P ＜ 0. 01，差异有统计学意义) 。说明凉血消风汤治疗有效。

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，其主要 功能单位为位于线粒体内膜上的线粒体呼吸链。线粒体呼吸链由五个复合物构成，它们不但是 ATP 的主要 来源，也是 ＲOS 产生的主要场所。生理状态下，呼 吸链在传递电子过程中会有 2% 的电子逃逸，与氧气 反应产生超氧阴离子( O  2 ) ，O  2 部分还原生成过氧化 氢( H2O2 ) ，又进一步还原成羟自由基( ·OH) ，这些不 稳定的自由基统称为活性氧( ＲOS) 。一定浓度的 ＲOS 可参与细胞增殖、凋亡和 Ca 2 + 储存等生理过程， 是细胞正常生命活动所必须的。线粒体呼吸链可以不 断产生 ＲOS，而线粒体中存在许多的抗氧化酶，谷胱 甘肽过氧化物酶( GSH － Px) 等可以清除由活性氧和 ·OH 诱发的脂质过氧化物，使 ＲOS 维持在较低生理 水平。若线粒体功能障碍则会出现 ＲOS 生成的增 多和抗氧化因子生成减少，从而使体内的抗氧化防御 系统遭到破坏，大量 ＲOS 在体内蓄积，破坏脂质、蛋白 质、DNA 的结构和功能，从而导致氧化应激的发生。细胞凋亡主要有两大经典途径，即以线粒体为中 心的内源性凋亡途径，以及由死亡受体介导的外源性 凋亡途径。目前大多数学者认为，线粒体功能障碍起 源的凋亡途径在凋亡发生过程中起核心作用。过多 的 ＲOS 可以引起构成线粒体内膜的脂质和蛋白质损 伤，促使线粒体内膜流动性和通透性改变，通透性转换 孔( m PTP) 开启。m PTP 开启可改变线粒体膜电位和 渗透压，使线粒体发生肿胀，线粒体呼吸链功能减弱， 甚至使线粒体膜破裂。细胞色素 C 从线粒体释放标 志着细胞凋亡的开始，线粒体膜通透性增加后细胞 色素 C 被释放到细胞质中激活 caspase 家族并诱导 caspase 级联反应，最终使 caspase3 激活。而活化的 caspase3 可使多聚 ADP － 核糖聚合酶中与 DNA 结合 的 2 个锌指结构与羧基端的催化区域分离，从而引起 细胞凋亡。





 

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