浅谈分子流行病学研究

新德里金属 β-内酰胺酶( New Delhi metallo-betalactamase，NDM) 是一种新型的碳青霉烯酶，于 2009 年 首次从印度新德里一所医院住院患者体内的肺炎克雷 伯菌和大肠埃希菌中分离得到。自从 2010 年产NDM 的肺炎克雷伯菌在我国浙江地区被首次报道以来，现已在全国多个地区的不同菌种中均有不同程 度的流行。

1 材料与方法

1． 1 菌株来源

收集 2017 年 6 月—2018 年 2 月浙江 大学丽水医院临床分离的碳青霉烯类抗菌药物耐药的 大肠埃希菌，通过药敏检测及 PCＲ 验证分离出共 9 株 产 NDM 的大肠埃希菌( 已删除重复菌株) 。分别来源 于新生儿科( 3 株) 、妇科( 2 株) 、重症医学科( 1 株) 、 急诊( 1 株) 、血液内科( 1 株) 和肾内科( 1 株) 。其中 有 4 株分离自尿液，3 株分离自全血，2 株分离自痰液。

1． 2 仪器和试剂

药敏 M-H 培养基和药敏纸片均购 自英国 Oxoid 公司，包括美罗培南、亚胺培南、厄他培 南、氨苄西林、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、 妥布霉素、左氧氟沙星、阿米卡星、米诺环素、多黏菌素 B 等。Vitek-2 Compact 全自动微生物鉴定仪购自法国 梅里埃公司。采用的 PCＲ 扩增仪为 PTC-200 Peltier Thermal Cycle，电泳仪、电泳槽购自上海天能科技有限 公司，ZF-1紫外分析仪购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司，DNA marker 购自全式金生物技术有限公司，引物及测序由生工生 物工程( 上海) 有限公司完成。

1． 3 药敏试验

采用 Vitek-2 Compact 全自动微生物 鉴定仪联合纸片扩散法( K-B 法) 进行药敏试验，药敏 结果按照美国临床和实验室标准化协会( CLSI) 2017 年的标准判定。

1． 4 耐药基因检测和序列分析

热裂解法提取菌株 DNA。采用 PCＲ 技术筛选可能携带的耐药基因。本 研究 中 纳 入 的 耐 药 基 因 包 括: β-内 酰 胺 酶 基 因 ( blaNDM、blaSHV、blaTEM、blaCTX-M) ; 喹诺酮类耐药基因和碳青霉烯类耐药基因( OXA-48、KPC) ; PCＲ 扩增 后将产物送至上海生工生物有限公司进行双向测序， 测序结果经 BLAST ( http: / /blast． ncbi． nlm． nih． gov / blast． cgi) 确定耐药基因分型。

1． 5 质粒复制子分型

碱裂解法提取细菌质粒，采用 PCＲ 技术对所有菌株进行质粒复制子类型的筛选分析。

1． 6 肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应 ( EＲIC-PCＲ) 分型

热裂解法提取细菌 DNA，采用存在于肠杆菌科细菌 DNA 中的重复序列为引物，EＲIC1: 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，EＲIC2: 5’- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’进行 PCＲ 反应扩 增，然后将产物于 1% 琼脂糖凝胶中，120 V 电泳 20 min 后用凝胶成像仪观察电泳条带的分布并对其进行 分型。

1． 7 多位点序列分型( MLST)

采用 PCＲ 法对大肠 埃希菌的 7 个管家基因( adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA) 进行扩增并测序，引物序列参考网站 https: / / mlst． warwick． ac． uk /mlst /dbs/Ecoli。并将所得的测序 结 果 于 https: / /pubmlst． org /bigsdb? db = pubmlst _ mlst_seqdef 网站上进行比对，得出菌株的序列分型。

1． 8 质粒转移接合试验

以这 9 株产 NDM 的大肠埃 希菌为供体菌，以耐叠氮钠的大肠埃希菌 J53 为受体 菌。供体菌和受体菌分别接种于 4 mL LB 肉汤培养基 中，35 ℃，200 r/min 培养 4 h，然后各吸取 100 μL 到 4 mL新鲜的 LB 中，混合后于 35 ℃ 培养箱静止孵育 16 ～ 18 h，后取 0． 1 mL 混合菌液涂布于含氨苄西林 ( 100 mg /L) 和叠氮钠( 100 mg /L) 的琼脂平皿上，培养 箱孵育 16 ～ 18 h，挑取在平皿上生长的疑为转移接合 子的菌落接种至氨苄平皿，后续进行菌种鉴定、药敏试 验、PCＲ 检测耐药基因以确定为转移接合子。

2 结 果

来源及临床特征 9 株产 NDM 的 大肠埃希菌中有 4 株分离自尿液( 44． 5% ) ，3 株分离 自全血( 33． 3% ) ，2 株分离自痰液( 22． 2% ) 。其中有 3 株来自新生儿科，2 株来自门急诊，血液内科、肾内 科、妇科和重症医学科各 1 株。患者性别、年龄及临床 诊断等相关信息见表 1。

9 株产 NDM 的大肠埃希菌呈现 多重耐药性，其中对 β-内酰胺类和喹诺酮类耐药率最 高，在这类药物中除了对氨曲南的耐药率较低为 33． 3% 外，其余耐药率为 100． 00% 。对碳青霉烯类抗 菌药物美罗培南、亚胺培南和磺胺类抗菌药物复方新 诺明的耐药率均为 100． 00% 。对氨基糖苷类抗菌药 物妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星等耐药率较低，分别 为22． 2% 、33． 3% 、0． 0% 。对四环素类抗菌药物米诺环素耐药率为 22． 2% 。

3 讨 论

自新德里金属 β-内酰胺酶-1 型( New Delhimetallo-β-lactamase 1，NDM-1 ) 于 2009 年在印度首次报 道以来，携带该基因的细菌已被发现在全球范围内 流行并引发多种类型感染。目前已发现的 NDM 亚型有 17 种，分 别 为 NDM-1 ～ NDM-17 型，其 中 以 NDM-1 亚型最为多见。携带 blaNDM-1 基因的菌株往 往同时携带有编码其他抗菌药物相关的耐药基因，如 β 内酰胺酶类、喹诺酮类和氨基糖苷类等，导致只有 少数抗菌药物如多黏菌素、替加环素等对此类细菌具 有一定的抗菌作用，该类病原菌也因此被称为“超级细 菌”。而在本研究中 9 株产 NDM 的大肠埃希菌均 为 NDM-5 型。NDM-5 与 NDM-1 只有 2 个氨基酸的差 别，262 位氨基酸由 G 变为 T 和 460 位 A 变为 C。 相较于 NDM-1，NDM-5 对碳青霉烯类和广谱 β 内酰胺 类抗菌药物具有更高的耐药水平。