分析无菌检查及适用性研究

注射剂无菌检查是药品质量控制的一个重要环 节，微生物的生长受许多因素的影响，为保证药品安 全、有效，并与国际接轨，提高我国药品标准，从《中 华人民共和国药典》2005 年版起均要求对药品进行 无菌检查，并规定了验证的方法、菌株及判断标准。

1 材料与仪器

1．1 材料

复方甘草酸苷注射液，兰州大得利生物化学制 药有限公司，国药准字 H20090231，每支20 mL，批号 20170201，20170202; 硫乙醇酸盐流体培养基( 批号20170311) 、 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 ( 批 号 20170830) 、胰 酪 大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 ( 批 号 20170425) 、沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 ( 批 号 20170421) 、沙 氏 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 ( 批 号 20170412) 、pH 7． 0 氯化钠 － 蛋白胨缓冲液( 批号 20170411) ，均购自北京三药科技开发公司，培养基 灵敏度及无菌检查均符合《中华人民共和国药典》 2015 年版规定。大肠埃希菌、枯 草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 、生孢梭菌、 白色念珠菌和黑曲霉，均购于中国食品药品检定研究院。

1．2 仪器

LA2－4A1 生物安全柜( 新加坡艺思高科技有限 公司) ，MJ － 250 生化培养箱( 上海一恒医疗机械 厂) ，GL-1700干式恒温器( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司) 。

2 方法与结果

1) 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基 中，于 30～35 ℃条件下培养 18 ～ 24 h，用 pH 7．0 氯 化钠－蛋白胨缓冲液稀释制成菌悬液，取适宜稀释 级菌悬液 1 mL，置于直径为 90 mm 的无菌平皿中， 注入 20 mL 温度不超过 45 ℃ 的胰酪大豆胨琼脂培 养基中，每个菌液浓度注 2 个平皿，混匀，凝固，倒置 培养，测定菌悬液中菌落的数量。
2) 接种生孢梭菌 的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于 30 ～ 35 ℃条件下培养 18 ～ 24 h，用 pH 7．0 氯化钠－蛋白 胨缓冲液稀释制成菌悬液，取适宜稀释级菌悬液 1 mL，置于硫乙醇酸盐流体培养基中，计数。
3) 接 种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养 基中，于20～25 ℃条件下培养 24 ～ 48 h，用 0．9%无 菌氯化钠溶液稀释制成菌悬液。
4) 接种黑曲霉的 新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，培养 5 ～ 7 d，加入 3 ～ 5 mL 0．9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗 脱，吸出孢子悬液( 用管口带有薄的无菌棉花或纱 布的能通过滤菌丝的无菌毛细吸管) 至无菌试管 内，用 0．9%无菌氯化钠溶液稀释制成孢子悬液，取 适宜稀释级菌悬液 1 mL，置于直径为 90 mm 的无菌 平皿中，每个菌液浓度注 2 个平皿，注入 20 mL 温度 不超过 45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基中，混匀，凝 固，倒置培养，测定菌悬液中菌落的数量。取装有滤膜孔径为 0．45 μm 的 二联封闭薄膜过滤器 3 组( 共 6 个滤筒) ，分别加入 与试验组过滤筒内相同且等量的培养基和小于 100 cfu的试验菌，作为菌液对照组。

3 讨论

复方甘草酸苷注射液为复方制剂，其组分为甘 草酸苷、盐酸半胱氨酸和甘氨酸。由本研究预试 验结果可知，采用常规方法直接过滤样品，对大肠埃 希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲 霉均无抑制作用; 加入金黄色葡萄球菌 72 h 内结果为阴性，说明复方甘草酸苷注射液中含有抑菌成分。经进一步试验，每膜采用 pH 7．0 的0．1%无 菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 200 mL 冲洗，完全消除了 样品对金黄色葡萄球菌的抑制作用，所以确定复方 甘草酸苷注射液无菌检查方法为: 取复方甘草酸苷 注射液 10 支，先用 pH 7．0 的 0．1%无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液浸润 2 筒过滤器滤膜，过滤样品，每膜经 pH 7．0 的 0．1%无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液200 mL 冲洗，最后加入 100 mL 硫乙醇酸盐流体培养基和胰 酪大豆胨液体培养基，以金黄色葡萄球菌作为阳性 对照菌进行无菌检查，方法可行。