大鼠海马神经元凋亡的抑制作用愿意分析！

脑血管疾病是严重危害人类健康的常见病和多 发病，其中缺血性脑血管疾病所占比例较大，缺血 性脑血管 疾 病 的 发 病 率、致残率和死亡率均比较 高。缺血性脑卒中引起脑损伤的机制比较复杂，神 经元细胞凋亡在脑损伤的发生过程中具有重要作 用，在脑缺血早期，缺血区域的病理生理学变化主 要为神经元坏死，在脑缺血后期缺血半暗带出现的 神经元死亡以细胞凋亡为主，神经元坏死为不可逆 的，而神经元凋亡受一些程序调控，对其进行干预 可减少神 经 元 凋 亡 的 发 生。ｐ３８丝裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 （ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ， ｐ３８ＭＡＰＫ）信号通路在神经元凋亡过程中发挥重要的调控 作 用，ｐ３８ ＭＡＰＫ 信号 通 路 的 激 活 可 促 进神经元凋 亡，抑 制 ｐ３８ ＭＡＰＫ 信号 通 路 可 抑 制 神经元凋亡，减轻脑组织损伤。

１ 材料与方法

１．１ 实验动物、主要试剂和仪器

健康清洁级雄 性ＳＤ大 鼠 １０２ 只，购自上海斯莱 克实验动物公 司，动物许可证号：ＳＣＸＫ （沪）２００７－０００５。丁苯 酞注射液 （石药集团 恩 必 普 药 业 有 限 公 司，批 号： ６１８１５０４１１），苏木素－伊红 （ＨＥ）染色试剂盒和原 位末端转移酶标记 （ＴＵＮＥＬ）染色试剂盒等 （美 国 Ｇｉｂｃｏ公司），聚氰基丙烯酸正丁酯 （ＢＣＡ）试 剂盒、辣根过 氧 化 物 酶 （ＨＲＰ）标记的山羊抗兔 抗体、肌动蛋白 （β－ａｃｔｉｎ）抗体、兔抗大鼠激活型 ｃａｓｐａｓｅ－３ （ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３）单克 隆 抗 体、兔 抗 大鼠 Ｂ 淋 巴 细 胞 瘤－２ 基因 （Ｂｃｌ－２）单克 隆 抗 体、 兔抗大 鼠 Ｂｃｌ－２相关 Ｘ 蛋 白 （Ｂａｘ）单克 隆 抗 体、 兔抗大 鼠 ｐ３８ 单克 隆 抗 体、兔 抗 大 鼠 磷 酸 化－ｐ３８ （ｐ－ｐ３８）单克隆抗体和兔抗大鼠丝裂原活化蛋白激 酶 （ＭＡＰＫ） 单 克 隆 抗 体 （美 国 Ｓｉｇｍａ 公 司 ）， ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 引 物设计与合成均由上海生物工程技术有限公司完 成。细胞 培 养 箱 （美 国 Ｔｈｅｒｍｏ公司），倒置 相 差 显微镜 （日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），脱色摇床 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司），电泳仪 （美国 Ｂｉｏ－ Ｒａｄ公司）和定量 ＰＣＲ仪 （美国 ＡＢＩ公司）。

１．２ 实验动物分组和缺血性脑卒中大鼠模型的建立

将１０２只大鼠随机分为假手术组、模型组和丁 苯酞组，每组３４只。模型组和丁苯酞组大鼠建立 缺血性脑卒中大鼠模型 （采用改良Ｚｅａ－Ｌｏｎｇａ法制 备局灶性脑缺血大鼠模型）：各组大鼠麻醉成功后， 剪开额顶部皮肤，暴露左侧半颅骨和颅骨前囟，采 用激光多普勒血流仪记录大鼠左侧大脑中动脉血流 情况，左侧大脑中动脉血流数值平稳后将大鼠仰卧 位固定于动物手术台上，剪开颈部皮肤，暴露并分 离颈总动脉、颈外动脉以及颈内动脉，结扎颈总动 脉近心端及颈外动脉，夹闭远端颈内动脉，距颈内 动脉分叉１ｃｍ 处剪一切口，将尼龙线 （头端涂上 硅胶）自左侧颈总动脉插入颈内动脉至感到少许阻 力，线栓到达大脑中动脉分叉处，栓塞成功的标准 为血流仪显示大脑中动脉血流 下 降 至 基 础 值 的 ２０％～３０％，栓 塞 成 功 后 固 定 线 栓，缝 合 伤 口， ２ｈ 回抽线栓恢复再灌注，大鼠模型制备完成。假 手术组大鼠不结扎和插线颈总动脉近心端及颈外动 脉，其他手术步骤同模型组。建模成功的标准：大 鼠提尾悬空实验阳性、向对侧转弯、同侧眼裂减小 和对侧肢体瘫痪。建模成功后，丁苯酞组大鼠腹腔注射丁苯酞注 射液 （４．５ｍｇ·ｋｇ－１），每天１次，假手术组和模 型组大鼠每天相同时间点腹腔注射等量生理盐水， 共２周。

１．３ 组织标本处理

实验结束时，假手术组大鼠 均存 活； 丁 苯 酞 组 大 鼠 死 亡 ２ 只， 予 以 剔 除， ３２只纳入研究；模 型 组 大 鼠 建 模 失 败 １只，死 亡 １只，予 以 剔 除，３２ 只 纳 入 研 究。 假 手 术 组 取 １７只大鼠，模型组和丁苯酞组各取１６只大鼠经心 脏灌注多聚甲醛固定液后取脑，脑组织经固定、脱 水、石蜡 包 埋，用 于 ＨＥ 染 色 和 ＴＵＮＥＬ 染 色； 假 手 术 组 取 １７ 只 大 鼠，模型组和丁苯酞组各取 １６只大 鼠 断 头 取 脑， 液氮速冻后保存， 用 于 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法和 ＲＴ－ＰＣＲ法检测。

１．４ 大鼠海马

ＣＡ１区 ＨＥ 染色 将 各 组 大 鼠 石 蜡包埋海马组织切成厚度５μｍ 的切片，进行常规 ＨＥ染色，显微镜下观察神经元形态学变化，选择 海马 ＣＡ１区明 显 的 层 面，４００倍高 倍 视 野 下 观 察 细胞形态表现，计算每个高倍视野中残留神经元数 量。

１．５ 大鼠海马

ＣＡ１区神经元 ＴＵＮＥＬ 染色 将 各大鼠石蜡包埋海马组织切片脱蜡至水，加入双氧 水孵育４０ｍｉｎ以消除内源性过 氧 化 酶 活 性，加 入 蛋白酶 Ｋ 孵 育１０ｍｉｎ，ＴＵＮＥＬ 反应 液 孵 育１ｈ， ＰＯＤ－转化液孵育３０ｍｉｎ，ＤＡＢ显色１０ｍｉｎ，苏木 素复染，脱水、透 明、封 片，高 倍 显 微 镜（×４００） 下观察 ＴＵＮＥＬ染色情况，ＴＵＮＥＬ阳性细胞为细 胞核 固 缩 并 被 染 成 黄 褐 色 或 棕 黄 色，计 算 海 马 ＣＡ１ 区神经元凋亡指数。 神 经 元 凋 亡 指 数 ＝ ＴＵＮＥＬ染色阳性的神经元／总神经元×１００％。

１．６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测

各组大鼠海马组织中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８、ｐ－ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 蛋白表达水平 将各组大鼠海马组织放入 ＥＰ管中，加入蛋白裂解液研磨均匀，提取海马组 织总蛋 白，采 用 ＢＣＡ 法测 定 海 马 组 织 蛋 白 浓 度， 采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法 测 定 大 鼠 海 马 组 织 中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８、ｐ－ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 蛋 白 表 达 水 平， 以 兔 抗 大 鼠 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３单克隆抗体、兔抗大鼠 Ｂａｘ单克隆抗体、 兔抗大鼠 Ｂｃｌ－２单克隆抗体、兔抗大鼠 ｐ－ｐ３８单克 隆抗 体、兔 抗 大 鼠 ｐ３８ 单克隆抗体和 兔抗大鼠 ＭＡＰＫ 单克隆抗体为一抗，以β－ａｃｔｉｎ为内参，山 羊抗兔抗体 （ＨＲＰ标记）为 二 抗。目 标 蛋 白 的 相 对表达水平＝目标蛋白条带灰度值／β－ａｃｔｉｎ条带灰度值。

２ 结 果

实验过程中假手术组大 鼠无死亡，丁苯酞组大鼠死亡２只，模型组大鼠建 模失败１只、死亡１只，予以排除。各 组 大 鼠 海 马 ＣＡ１ 区 ＨＥ染色结果：假手 术 组 大 鼠 海 马 ＣＡ１区神 经 元细胞排列整齐，细胞核位于细胞中央，细胞膜完 整；模型组大鼠海马 ＣＡ１区神经元细胞排列紊乱， 细胞肿 胀 破 裂，细 胞 核 固 缩；丁苯酞组大鼠海马 ＣＡ１区部分神经细胞结构恢复正常，排列尚完整， 细胞膜基 本 完 整。各组 大 鼠 海 马 ＣＡ１区神经元 ＴＵＮＥＬ 染色 结 果：假 手 术 组 大 鼠海 马 ＣＡ１ 区基 本 无 ＴＵＮＥＬ 染色 阳 性 神 经 元； 模型组大鼠海马 ＣＡ１区可见大量 ＴＵＮＥＬ 染色 阳性神经元，神经元胞体缩小，细胞核固缩崩解，呈 黄褐色或棕黄色颗粒；丁 苯 酞 组 大 鼠 海 马 ＣＡ１区 见少量 ＴＵＮＥＬ 染 色 阳 性 神 经 元。与 假 手 术组 比 较，模型组和丁苯酞组大鼠海马组织中 ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ 和 ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ 表 达 水 平明显升高 （Ｐ＜０．０１），Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ 表达水平明 显降低 （Ｐ＜０．０１）；与模 型 组 比 较，丁 苯 酞 组 大 鼠 海 马 组 织 中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、 Ｂａｘ 和 ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表达水平明显 降 低 （Ｐ ＜０．０１）， Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ 表 达 水 平 明 显 升 高 （Ｐ ＜０．０１）。

3 讨 论

细胞凋亡的诱导和调控比较复杂，ｃａｓｐａｓｅｓ为 凋亡的 最 后 执 行 因 子，凋亡的实施通过 ｃａｓｐａｓｅｓ 的激活而 完 成 的，ｃａｓｐａｓｅ－３为ｃａｓｐａｓｅｓ级联 反 应 下游的关 键 因 子，在 凋 亡 程 序 的 启 动 中 起 枢 纽 作 用，ｃａｓｐａｓｅ－３可水解脱氧核糖核酸酶的抑制蛋白， 使脱氧核糖核酸酶活化进入细胞核、使 ＤＮＡ 断裂 从而导致细胞凋亡；ｃａｓｐａｓｅ－３还可裂解 Ｂｃｌ－２，使 其失去活性从而发挥促凋亡作用；脑缺血可通过多 种途径激活ｃａｓｐａｓｅ－３，进而引起神经元凋亡。 Ｂｃｌ－２为一种癌基因，对细胞凋亡具有抑制作 用；Ｂａｘ为 Ｂｃｌ－２家族成员 之 一，是 人 体 重 要 的 凋亡基因，可 与 Ｂｃｌ－２形成 二 聚 体 而 对 Ｂｃｌ－２产生 抑制作用。Ｂａｘ和 Ｂｃｌ－２间的平衡关 系 对 细 胞 凋 亡具有调控作用，脑缺血时脑组织中 Ｂａｘ和 Ｂｃｌ－２ 平衡失 调，Ｂａｘ水平 升 高、Ｂｃｌ－２水平 降 低，从 而 引起神经元凋亡的发生。 丁苯酞是治疗脑梗死的Ⅰ类新药，对缺血性脑 梗死的治疗效果比较显著，可通过多个环节阻断缺 血性脑损伤，其机 制 可 能 通 过 重 构 缺 血 区 域 微 循环、调 节 缺 血 区 域 血 流 量，增 加 脑 组 织 能 量 代 谢，减轻神经细胞凋亡，促进脑损 伤 的 修 复， 但丁苯酞对缺血性脑梗死的脑保护作用机制尚不清楚。