其林贝尔分析诱发心肌细胞凋亡的作用机制！

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI） 是由冠状动脉发生急性血栓而诱发心肌细胞大量死 亡引起的恶性疾病，是人类心血管疾病的主要死因。 研究发现，心肌缺血20 min便可造成不可逆损伤，急 性心肌梗死后再灌注治疗是目前减少心肌细胞死 亡、减少梗死面积的唯一有效治疗手段。然而，心 肌组织缺血后再灌注恢复了心肌血供，同时也加重 了心肌组织的损伤和心脏功能紊乱，这种现象称为 心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料

12只3~4个月的健康雄性C57BL/6 小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司； 依文思蓝（Evan’s blue）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑 （triphenyltetrazolium chloride，TTC）购自美国Sigma公 司；血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌钙蛋白T （cardiac troponin T，cTnT）测定试剂盒购自南京建成 生物工程研究所；半胱天冬酶 3（Caspase 3）检测试 剂盒购自美国BIOMOL公司；胎牛血清、青链霉素、 杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）培养基、胰蛋白酶、Hank’s液 均为美国Gibco公司产品；70 μm细胞过滤筛网购自 美国BD公司；抗鼠IL-17A、Caspase 3、Bax、Bcl-2、pAkt、Akt抗体、抗鼠GAPDH抗体、抗鼠或兔的辣根过 氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）偶联二抗 均为美国Cell Signaling Technology公司产品；4%多聚 甲醛、放射免疫沉淀法（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自碧云天公司；脱氧核糖核苷酸末 端 转 移 酶 介 导 的 缺 口 末 端 标 记 法（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP - biotin nick end labeling，TUNEL）凋亡检测试剂盒购自美国 Roche公司；重组小鼠IL - 17A（rmIL-17A）：货号 Q62386，购自美国R&D Systwm 公司。

1.2 小鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立

取健 康3~4个月雄性C57BL/6小鼠12只，随机分为假手术 （Sham）组和缺血再灌注（I/R）组，每组6只。用 40 mg/kg的4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，麻醉 后将其仰卧固定于鼠台，经口气管插管后连接小动 物呼吸机维持呼吸。胸前区剃毛，并用酒精消毒，于 左侧心尖搏动最明显处分离皮肤与肌层，剪开3~5 肋骨，暴露心脏并找到左冠状动脉前降支（left anterior descending，LAD），用8-0无损伤丝线于左心 耳下缘1~2 mm处穿过心肌表层结扎LAD，在结扎 LAD时内垫PE-50聚乙烯管，行缺血实验。缺血 45 min后，重新打开胸腔，打开线结移除PE-50管， 恢复供血。假手术组以相同方式手术，丝线仅从LAD 下方穿过，但不做结扎。

1.3 心肌梗死面积测定

小鼠心肌缺血45 min再灌 注3 h、24 h、72 h后打开胸腔，再次结扎LAD，自主动 脉注入1 ml 1% Evan’s blue染液，使相应心肌着色， 非缺血心肌呈蓝色，缺血区即危险区（area at risk， AAR）不染色。随后处死小鼠取出心脏，用滤纸吸干 置于-20 ℃冰冻10 min，从心尖处横向切成4片，每片 厚约1 mm，置于1% TTC磷酸缓冲液中37 ℃孵育 20 min，后用4%多聚甲醛固定过夜，此时梗死区呈 白色，非梗死区呈红色。采用高分辨率解剖显微镜 对每片心肌组织进行拍照，Image J软件分别对各个 染色区域进行定量，用梗死面积（infarct，I）与左心室 面积（left ventricle，LV）之比即梗死面积/危险区 （infarct/area at risk，I/LV）和梗死面积（infarct，I）与危 险区（AAR）之比即梗死面积/危险区（infarct/area at risk，I/AAR）来反映梗死的情况。取出生1天的C57BL/6小 鼠，超净台中用75%乙醇浸泡消毒，无菌眼科剪取出 心脏，置于无菌Hank’s液中将心脏中血液冲洗干 净，用眼科剪将心脏剪成1×1 mm小块，移入新培养 皿并加入3 ml胰蛋白酶消化液，4 ℃摇床（购至海门市其林贝尔仪器）孵育30 min， 终止消化1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入3 ml的 Liberase TH酶37 ℃消化15 min，70 μm细胞筛网过 滤，将所得细胞悬液离心并用含20%胎牛血清的 DMEM重悬，移至培养皿中培养60 min。此时，心脏 成纤维细胞贴壁，心肌细胞呈悬浮状态，收集悬浮的 心肌细胞，移入新培养皿培养，72 h后待心肌细胞贴 壁并同步化跳动，则可用于后续实验。

2 结果

小鼠经 LAD结扎45 min后再灌注3 h、24 h、72 h，采用Evan’s blue和TTC染色法染色发现，3 h、24 h和72 h均可见 缺血与梗死区，Sham组和I/R各个时间点的AAR/LV 之间相比均无统计学意义（46.3±4.1，45.2±4.6，46.9± 5.2，45.7±5.4；P>0.05），但I/R各个时间点的I/AAR较 Sham组显著增加，且随时间延长梗死面积逐渐扩大 （2.1±0.9，16.4±2.5，44.6±2.8，52.3±4.6；P<0.05）（图 1a）。如图1b和1c所示，I/R各个时间点血清肌酸激 酶（CK）和肌钙蛋白T（cTnT）较Sham组显著增加，且 随着I / R 时间延长呈增加趋势（346.53 ± 210.54， 2163.23±232.18，3174.28±526.45，3532.56±416.28； P<0.05和0.35±0.21，1.98±0.35，10.52±2.23，14.5±2.42； P<0.05），提示小鼠心肌损伤模型构建成功。I/R后随 着时间延长心肌组织中心肌细胞凋亡率显著增加且 各时间点心肌细胞凋亡率均明显高于Sham组（P< 0.05）；同时本研究还发现Caspase 3活性亦随着时间 逐渐增加，得到与TUNEL 染色一致的结果（P< 0.05）。为研究小 鼠I/R后心肌组织中高表达的 IL-17A 是否与心肌细 胞凋亡有关，本研究分离培养了小鼠原代心肌细 胞，并用10、20、40和80 ng/ml的IL-17A 分别处理细 胞24 h，TUNEL染色发现，IL-17A 能呈剂量浓度依 赖地促进心肌细胞凋亡（2.15 ± 0.65，11.25 ± 1.89， 16.78±2.56，24.16±4.61，38.96±5.16；P<0.05）。

3 讨论

心肌I/R损伤导致氧自由基大量产生、细胞坏 死、血管损伤以及渗透性的增加，在此过程中多种免 疫反应被激活并参与其中，各种细胞因子、免疫因子 相继产生，参与心肌炎症反应加重心肌损伤。起初，介导免疫应答的T细胞被认为不参与心肌I/R损 伤，然而近年来大量研究推翻了这一观点，CD4+ T细 胞参与了肝脏、肾脏、脑以及肠道I/R损伤。在心肌I/R中，CD3+ T细胞能够在短时间内浸润至梗死区， T、B细胞缺陷小鼠I/R后梗死面积更小，而恢复CD4+ T细胞后则是I/R损伤加重，CD4+ T细胞也被认为是IRI的主要损伤因素。