注损伤模型大鼠的保护机制分析

0 引言

中国每年有200多万人罹患脑血管疾病，而临床上治 疗脑缺血性疾病的唯一有效方法就是快速恢复脑组织的血 流使其再灌注。然而，在进行缺血在灌注的过程中，往 往会加重脑部的损伤，形成脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。因此在对脑缺血进行 救治的过程中，除了迅速恢复脑组织的灌注外，亦需要对 后续的再灌注损伤进行防治。脑缺血再灌注损伤的病理生 理过程十分复杂，一般认为，随氧化应激反应，细胞内出 现了Ca2+超载，并进一步引发血管功能的缺失，最终引发 细胞凋亡。同时，越来越多的研究显示，在脑缺血再灌 注损伤发病的过程中，细胞焦亡也发挥了重要的作用。细 胞焦亡是一种促炎性程序性细胞死亡，同细胞凋亡的程序 性主动死亡的不同，细胞焦亡诱发的细胞死亡效果更为 剧烈，其快速的形成质膜孔洞，诱发细胞肿胀进而坏死、 并释放细胞内的内容物和炎性递质。因此，细胞焦亡诱 发细胞死亡的过程更为直接，而对脑细胞带来的损伤也更大。

1 材料和方法

1.1 设计

随机对照动物观察。

1.2 时间及地点

实验于2017年12月至2019年4月在辽 宁中医药大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

健康雄性蒙古沙鼠80只，四五月龄，体 质量50-70 g，由哈尔滨医科大学动物学部提供。

1.3.2 药品和试剂

脑心清胶囊(沈阳东新药业有限公司， 批号：171002)；脑络通胶囊(广州市花城制药厂，批号： 20171002)。Nissl试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、乳酸 脱氢酶试剂盒、丙二醛试剂盒、谷胱甘肽试剂盒、一氧化 氮试剂盒、白细胞介素18和白细胞介素1β试剂盒均购自南 京建成生物医学工程研究所。血小板内皮细胞黏附因子1、 内皮型一氧化氮合酶和磷酸化内皮型一氧化氮合酶抗体购 自Abcam公司，ASC、NLRP3和Caspase-1抗体购自Sigma 公司。

1.3.3 主要仪器

水迷宫(成都泰盟科技有限公司)，酶标 仪(Thermo公司)，电泳仪及相关设备(Bio-Rad公司)，冰冻 切片机(Leica公司)，倒置显微镜(Nikon公司)，低温高速离 心机(Eppendorf公司)，超纯水装置(法国Millipore公司)， 核酸蛋白定量仪(瑞士Amersshams公司)，精密天平(瑞士 Mettler公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组和给药方法

将80只雄性蒙古沙鼠随机 分为假手术组、模型组、脑心清组及脑络通组。术后次日 开始假手术组正常饲养，模型组灌服同体积的生理盐水， 脑心清组按照100 mg/(kg•d)灌胃给药，脑络通组按照 100 mg/(kg•d)灌胃给药，连续给药21 d。其中，在实验结 束前1周进行水迷宫实验，包括4 d的隐蔽平台实验和1 d的 空间探索实验。而Nissl染色、免疫荧光实验以及各marker 检测，则在实验结束麻醉下处死沙鼠后进行。

1.4.2 建立脑缺血再灌注损伤模型

随机选取健康蒙古沙鼠，戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉后，用无创微 动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉5 min，然后松开动脉夹，重 新恢复血流进行再灌注，制成沙鼠脑缺血再灌注损伤模型， 缝合皮肤。假手术组不夹闭双侧颈总动脉，其他手术操作 与模型组相同。

1.4.3 水迷宫实验

水迷宫直径200 cm，水深30 cm，水 温(20±3) ℃，将水面平均分为4个象限。每只沙鼠每日训 练2次，60 s/次，共计3 d。第4天开始进行定位航行实验， 平台放置在任意象限，且位于水下1.5 cm，选取平台邻象 限和对象限作为入水点，记录沙鼠在60 s内寻找到平台的 时间，空间探索实验记录动物通过平台所在象限的次数。

1.4.4 Nissl染色

实验结束，每组随机选取6只沙鼠(剩余 沙鼠用于氧化应激指标检测和Western blot实验)麻醉后处 死，取脑组织制备切片，每只取3张脑片，滴加Nissl染色 液，室温孵育10 min。PBST洗3次，每次5 min，中性树脂 封固，镜下观察。

1.4.5 免疫荧光实验

沙鼠脑组织冰冻切片，PBS洗片3 次，每次5 min；冰上操作，0.2%Tritonx-100致孔15 min， PBS洗片3次，每次5 min。山羊血清封闭60 min后直接滴 加血小板内皮细胞黏附分子1一抗(1∶200)，4 ℃条件下孵 育24 h，PBS洗片3次，每次5 min，避光条件下，滴加荧 光二抗(1∶100)室温孵育30 min，PBS洗片3次，每次5 min； 滴加DAPI染核5 min，PBS洗片3次，每次洗5 min。甘油封固，荧光显微镜下观察。将待测试管以快速振荡器（海门市其林贝尔恒温微孔板快速振荡器QB-9006）混匀后，以保鲜膜扎紧试管 口，并刺破小孔。95 ℃沸水浴40 min后，取出冷却，再 3 500-4 000 r/min，离心10min。取上清液在532 nm处， 以双蒸水为对照，测定各管的吸光度。

2 结果

实验选用沙鼠80只，分成4组， 实验过程有脱失，进入结果分析至少14只。水迷宫定位航行实验结果显示，模型组沙鼠的逃 避潜伏期与假手术组相比明显延长(P < 0.01)；脑心清组和 脑络通组沙鼠的逃避潜伏期与模型组相比明显缩短(P < 0.01)。空间探索实验结果显示，模型组沙鼠在目标象限的 游泳时间、有效停留时间及穿梭次数明显减少(P < 0.01)； 与模型组相比，脑心清组和脑络通组沙鼠在目标象限的游泳 时间、有效停留时间及穿梭次数明显增加(P < 0.01)。Nissl染色结果显示，假手术组沙鼠的海马CA1区锥体 细胞排列整齐、紧密，细胞结构清晰完整，细胞核正常， 染色质分布均匀，胞浆内尼氏小体丰富。模型组沙鼠的海 马CA1区可见部分神经元丢失，排列不整齐，细胞轮廓模 糊，结构不清，部分神经元胞体皱缩，核固缩，胞浆深染， 胞浆内尼氏小体减小。与模型组相比，脑心清组及脑络通 组神经元显著增多，且排列较为整齐，细胞轮廓清晰，结 构完整，神经元胞体舒展，胞浆内尼氏小体增大。通 过试剂盒检测沙鼠海马组织白细胞介素18和白细胞介素 1β的水平，结果显示，与假手术组相比，模型组沙鼠的白 细胞介素18和白细胞介素1β质量浓度明显升高(P < 0.01)； 与模型组相比，脑心清组及脑络通组沙鼠的白细胞介素18 和白细胞介素1β质量浓度明显降低(P < 0.01)。

3 讨论

脑组织的血流供应中断可引起一系列缺血级联反应， 而随治疗恢复供血后，脑部又会产生脑缺血再灌注损伤。 由于脑缺血再灌注损伤会改变脑血管的形态及功能，进而 降低脑部的物质交换能力，随供血供氧减少，诱发后续的 氧化及炎症反应，最终损伤脑细胞。由脑缺血再灌注损 伤的发生机制可知，该过程是一个多通路多靶点的协同过 程。而在治疗的过程中，最有效的办法的则是对脑缺血再 灌注损伤发病所对应的相关通路全部进行抑制或阻断，而 根据此次研究的结果可以看出，脑心清胶囊可以从多个角 度缓解脑缺血再灌注损伤的症状。