新颖木聚糖酶基因重组酶酶学性质分析

我国是农业大国，伴随着农产品生产加工，每 年产生大量农业废弃物。 这些农业废弃物资源再 生利用率极低，大部分被浪费。 大力开发利用这 些资源可以缓解环境、资源和粮食危机，因此农业 废弃物再利用成为近十几年各国研究的热点。 木 聚糖是结构比较复杂的半纤维素， 为世界第二大 可再生资源。 由于木聚糖结构复杂，它的彻底水 解需要一系列酶的协同作用， 其中最关键的酶是 木聚糖酶。 在众多应用中，以木聚糖经酶法制取 有较高附加值的功能低聚糖， 是富含半纤维素材 料的农业废弃物再生利用的有效增值途径， 具有 巨大的潜在经济效益和环保意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

土壤样品来自云南、贵州、河南、河北等 15 个 地区。 样品采用铁铲采集，用刮刀除去 5 cm 厚的 表层土。 将采集的土壤样品保存于无菌塑料袋中， 于-4 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要试剂

DNA 琼脂糖凝胶回收 试剂盒 （ 美 国 OMEGA）；琼脂糖（西班牙 Biowest）；十六烷基三甲 基溴化铵（CTAB）、十二烷基磺酸钠（SDS）购自上 海生工生物技术有限公司；RNA 酶， 蛋白酶 K 来 自 （日本 TAKARA）；Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 连 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、 DL2000、1 kb Plus DNA Ladder，pUC19、E.coli DH5、pET28a 载 体 、E.coli BL21 （DE3）感 受 态 细 胞 （日本 TAKARA）； 氨苄霉素 （Amp） 蛋白 胨 （Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）（英国 Oxford 公司）；Gel Exraction Kit （美国 OMEGA）；刚 果 红，卡 那 霉 素（美 国 AMRESCO）；榉 木 木 聚 糖 （美国 Sigma）。

1.3 主要设备与仪器

DYC P-31BN 水 平 电 泳 槽 、DYY-10C 电 泳 仪， 北京六一仪器厂；Image Quant 300 凝胶成像仪、Multitemp III 恒温循环水浴器， 美国 GE 公 司；Sigma 1-14 小型台式高速离心机，美国 Sigma 公司；WD-9405B 型水平摇床，北京六一；PCR 仪， Biometra，德国；ImageQuant 300 凝胶成像仪，Multitemp III 恒温循环水浴器，美国 GE；琼脂糖凝胶 电泳仪，北京六一；DHZ-DA 全温振荡器，江苏太 仓培英；万向摇床TS-92型,海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Nanodrop 核酸定量仪，Thermo 公司。

1.4 土壤宏基因组文库构建

每次称取 80 g 土壤， 用提取缓冲液 （TrisHCl：100 mmol/L pH 8.0； EDTA：100 mmol/L， pH 8.0；NaCl：1.5 mol/L；CTAB：1%） 溶 解 稀 释 土 样 ， 225 r/min。 混匀 2～3 h。 具体提取方法参照 Zhou 等 1。 将回收后的 DNA 片段采用 Sau3A I 进行部分 酶切，并与经 BamH I 酶切后与 pUC19 载体进行 连接，电转化法导入到 DH5α 中。

1.5 土壤宏基因组文库的筛选

土壤宏基因组文库的筛选方法参照 Kwon 等， 将文库中的克隆子转接到含有 0.5%的木聚 糖底物的平板上培养 24 h，将平板放置在 50 ℃烘 箱 30 min 后，刚果红染色 15 min， 1 mol/L 的 NaCl 脱色 15 min， 在底物平板上能产生透明圈的克 隆即为阳性克隆。

1.6 木聚糖酶基因

cbxynA 序列分析 对上述筛选得到的阳性克隆子提取质粒并测 序， 用在线软件预测外源插入片段所有可能的开 放阅读框，用 DNAMAN 预测目的基因可能的分子 质量和等电点。

1.7 重组酶

CBXYNA 的表达和纯化 利用 Primer5 软件设计引物， 扩增 cbxynA 的 ORF 编 码 序 列 。 在 序 列 N 端 正 （5’ -CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’） 引入 Xho I 位 点 ， 在 C 端 （5’ -CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’）引入 Nco I 位点。 将目的基因 cbxynA 经 Xho I 和 Nco I 双 酶 切 后 连 接 到 pET-28a （+） 载 体 并 转 化 到 BL21 （DE3）感受态细胞中进行异源表达。 对表达过程 中何时加入 IPTG 的诱导时机、加入 IPTG 诱导后 的温度、 诱导的时间及 IPTG 浓度等参数进行优 化。 收集菌体后用裂解液裂解，超声波破碎细胞后 离心收集上清粗酶液。 用 Ni 柱纯化粗酶液，先用2.5% wash&elution buffer 对柱料进行冲洗， 通过 A280 检测器对除杂蛋白情况进行监控，直至检测 器显示没有杂峰的出现。 用 wash & elution buffer 对柱料进行梯度洗脱 ， 梯 度 分 别 为 5% ，10% ， 20%，40%，60%，80%，100%。并将对应的出峰时间 的蛋白进行收集。 用 SDS-PAGE 电泳检测纯化后 的酶蛋白。

1.8 重组酶

CBXYNA 活力及酶学性质测定 以木聚糖为底物， 采用 DNS 法测定酶活力。 酶最适 pH 值和 pH 稳定性测定缓冲液体系为 pH 值 2.2～11。每种缓冲体系 5 个点，共 35 个点。重组 CBXYNA 酶活力的测定在 50 ℃下进行，将常规方 法中的缓冲液替换为上述不同 pH 体 系 的 缓 冲 液，测定所得酶活力记为 100%。 pH 稳定性是将酶 液稀释，使酶液处于不同的缓冲体系中，50 ℃下保 温 30 min 后立即冰浴终止反应，之后按照 DNS 测 定方法测定残余酶活力， 以未经保温处理的重组 木聚糖酶 CBXYNA 活力为 100%， 分别计算不同 pH 下的残余相对酶活力。 测定最适温度时， 用最适 pH 缓冲液将酶稀 释一定比例，然后置于 40～80 ℃的不同温度下，反 应 10 min，测定酶活力，以最大值为 100%。温度稳 定性的测定， 将样品与酶最适反应缓冲溶液以一 定比例混匀，置于不同温度（50，55，60，65，70 ℃） 中保温不同时间 （0，30 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h）。 定时取样，测定样品残留酶活力，以未处 理木聚糖酶活力作对照。 考察的金属离子 Na+ 、K+ 、Li+ 、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+对 CBXYNA 酶活力的影响。 酶 对底物特异性的研究，添加 1%（w/v）的燕麦木聚 糖、桦木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性 玉米芯木聚糖在 0.05 mol/L，pH 5.2 的 醋 酸 缓 冲 液中，反应时间为 10 min，反应温度为 55 ℃条件 下测定木聚糖酶活力。

2 结果与分析

从土壤中提取总的 DNA，经纯化浓缩后的 23 kb 以上的 DNA 的量约为 6 μg。 因土壤环境中得 到的总 DNA 片段较长，不利于外源片段插入载体 中。 故采用 Sau3A I 酶对回收的土壤 DNA 片段 进行部分酶切， 再用 1%的琼脂糖凝胶回收 2～10 kb 以内的 DNA 片段约 2 μg 左右。将酶切时间设置为 1 h， 每 100 μL 加入 0.75 U 的 Sau3A I 酶，使得土壤 DNA 的条带分布在 2～ 8 kb，符合构建质粒土壤宏基因组文库。 酶切之后 的土壤 DNA 与 pUC19 载体经 T4 连接酶连接后， 导入到 DH5α 中。 将转化产物涂布平板后获得了 大量宏基因文库克隆子。 从文库中随机提取 10 个 克隆子并提取质粒，用 EcoR I 和 Hind III 双酶切 之后，结果表明：质粒间插入的外源酶切带型差异 显著，文库克隆片段随机性较高。 外源插入大小为 1.5～4.5 kb，平均为 3 kb，粗略计算，宏基因组的库 容量为 30 Mb。将筛选得到的阳性克隆子 Cb5545 测序，得到 一段 4 238 bp 的 DNA 序列，并预测了该外源插入 片段的所有可能开放阅读框， 其中开放阅读框 ORF10 是一个 822 bp 长的编码木聚糖酶的完整 的开放阅读框， 其编码产物的氨基酸序列与来自 Halobacteriaceae archaeon（古细菌属）编码的木聚 糖酶的相似度最高也仅为 45%， 表明该序列是一 条未知的新序列 （GenBank 登记号：KY062986）。 该基因编码的产物由 273 个氨基酸组成， 预测的 分子质量为 29.1 ku，等电点为 5.2。将目的基因 cbxynA 克隆到 pET-28a（+）表达 系统里进行异源表达。 对重组质粒何时加入 IPTG 诱导的时机、加入 IPTG 后的诱导时间、诱导温度 及 IPTG 浓度进行优化。 最终的优化结果如图 4 所 示。 结果表明：培养 5 h 后，添加 IPTG 终浓度为 0.7 mmol/L，在 23 ℃下诱导 25 h，获得的最大酶活 力为 52 U/mL，较初始值提高了 4.3 倍。

3 结论

研究从土壤宏基因文库中筛选并鉴定出一个 木聚糖酶基因 cbxynA，经分析表明该基因是一段 未知的新序列。 随后对该基因进行克隆表达，对其 原核表达条件进行了优化， 最终获得其最大酶活 力为 52 U/mL，较初始值提高了 4.3 倍。 重组木聚糖 酶 CBXYNA， 其 最 适 pH 为 5.2，pH 在 4.2 到 10.2 之间时其酶活力在 70%以上， 有较好的 pH 稳定性。 CBXYNA 的最适温度为 55 ℃，在 50～60 ℃保温 30 min 酶活力仍在 80%以上， 具较好的热 稳定性。 Na+ 、K+ 、Ca2+、Li+ 在 1～7 mmol/L 的范围之 内对酶有促进作用，Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+对酶有抑制作用， 且抑制作用随着金属离子浓度的升 高而增强。其中，Cu2+对酶的抑制作用最明显，几乎 使其完全丧失酶活。 当该酶以水溶性玉米芯木聚 糖、燕麦木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力 分别为 162%，139%，74%， 说明该 CBXYNA 更容 易结合水解水溶性木聚糖底物。 重 组 木 聚 糖 酶 CBXYNA 有较好的 pH 稳定性， 可用于造纸、饲 料、食品等工业应用中。 同时该酶以燕麦木聚糖、 水溶性玉米芯木聚糖为底物时，酶活力相对较高， 有较强的亲和能力， 可被用于水解可溶性木聚糖 底物制备低聚木糖。