真菌毒素的快速筛查和确证

真菌毒素（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ）也叫霉菌毒素，是产毒 真菌在适宜环境条件下的次级代谢产物，具有生物 毒性。截至目前已分离得到 100 多种真菌，可产生 大约 300 种有毒的次级代谢产物。农产品中常见 的真菌毒素有黄曲霉毒素（ａｆｌａｔｏｘｉｎ）、赭曲霉毒素 （ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ）、玉米赤霉烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ）、伏马 毒素（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ）、杂色曲霉素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ）、 单端孢霉烯族毒素（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）以及橘青霉素 （ｃｉｔｒｉｎｉｎ）等。粮谷类农作物在种植过程中和贮藏 期间容易受到真菌的侵染，导致真菌毒素污染情况 普遍存在。由于近年来受全球气候变暖、干旱等 因素的影响，世界各国真菌毒素暴露事件屡见不鲜， 特别是粮谷产品中多种真菌毒素混合污染现象频频发生，真菌毒素多残留检测受到越来越多的关 注和重视。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

四 极 杆／ 静电场轨道阱高分辨质谱仪 Ｑ－ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、ＵｌｔｉＭａｔｅ 3000 高效液相色谱仪，Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ18柱（100 ｍｍ×2. 1 ｍｍ，1. 9 μｍ） （美 国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公 司）；Ｃａｐｔｉｖａ ＥＭＲ－Ｌｉｐｉｄ 净 化 柱 （3 ｍＬ，美 国 Ａｇｉｌｅｎｔ 公 司）； 3Ｋ15 离心机（德国 Ｓｉｇｍａ 公司）；ＤＬ－5Ｃ 低速大容 量离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＯＡ－ＳＹＳ 氮吹仪 （美国 Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ 公司）；Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 超纯水纯化系统 （美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司）；涡旋混合器（德国 ＩＫＡ 公司）。 黄曲霉毒素 Ｂ1 标准品溶液（ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｂ1，质量 浓度为 2. 0 ｍｇ ／ Ｌ）、黄 曲 霉 毒 素 Ｂ2 标 准 品 溶 液 （ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｂ2，质量浓度为 0. 5 ｍｇ ／ Ｌ）、黄曲霉毒素 Ｇ1 标 准 品 溶 液 （ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｇ1，质 量 浓 度 为 2. 0 ｍｇ ／ Ｌ）、黄曲霉毒素 Ｇ2 标准品溶液（ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｇ2， 质量浓度为 0. 5 ｍｇ ／ Ｌ）购自美国 Ｔｒｉｌｏｇｙ 公司；黄曲 霉毒素 Ｍ1（ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｍ1，纯度为 99. 8％）、脱氧雪腐 镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，纯度为 99. 6％）、3－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （3－ａｃｅｔｙｌ ｄｅｏｘｙｎｉ－ ｖａｌｅｎｏｌ，纯度为 99. 0％）、15－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌 烯醇（15－ａｃｅｔｙｌ ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，纯度为 99. 0％）、赭 曲霉毒素 Ａ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ－Ａ，纯度为 99. 9％）、黄曲霉 毒素 Ｍ2（ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｍ2，纯度为 99. 0％）、玉米赤霉烯 酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，纯度为 99. 0％）、黄绿青霉素（ｃｉｔ－ ｒｅｏｖｉｒｉｄｉｎ，纯 度 为 98. 0％）、蛇 形 菌 素 （ｄｉａｃｅｔｏｘｙ－ ｓｃｉｒｐｅｎｏｌ，纯度为 98. 0％）、伏马毒素 Ｂ1 标准品溶液 （ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ1，质量浓度为 99. 7 ｍｇ ／ Ｌ）、伏马毒素 Ｂ2 标 准 品 溶 液 （ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ2，质 量 浓 度 为 100 ｍｇ ／ Ｌ）、伏马毒素 Ｂ3 标准品溶液（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ3，质 量浓度为 100 ｍｇ ／ Ｌ）、ＨＴ－2 毒素（ＨＴ－2 ｔｏｘｉｎ，纯度 为 99. 0％）、Ｔ－2 毒素（Ｔ－2 ｔｏｘｉｎ，纯度为98. 0％）、杂色 曲霉素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ，纯度为 99. 2％）均购自美 国 Ａｃｈｅｍｔｅｋ 公司，桔青霉素标准品溶液（ｃｉｔｒｉｎｉｎ，质 量浓度为 10 ｇ ／ Ｌ）购自以色列 Ｆｅｒｍｅｎｔｅｋ 公司。 乙腈和甲醇（色谱纯，德国 Ｍｅｒｃｋ 公司）；甲酸 （色谱纯，美国 Ｄｉｋｍａ 公司）；甲酸铵（色谱纯，上海麦克林公司）；无水硫酸镁和氯化钠（优级纯，天津 科密欧公司）。

1．2 样品前处理

准确称取 5. 00 ｇ 样品于 50 ｍＬ 聚丙烯具塞离 心管中，加入 10 ｍＬ 水，涡旋混匀，再加入 10 ｍＬ 乙 腈（含 2％ 甲酸）、4 ｇ 硫酸镁和 1. 5 ｇ 氯化钠，振荡提 取 10 ｍｉｎ，在 4 ℃条件下，以 5 000 ｒ ／ ｍｉｎ 的速度离 心 5 ｍｉｎ，移出 8 ｍＬ 上层乙腈相，加入 2 ｍＬ 水，涡 旋混合。取 3 ｍＬ 萃取液上样到 Ｃａｐｔｉｖａ ＥＭＲ－Ｌｉｐｉｄ 净化柱，使其在重力作用下流过净化柱并收集净化 液，待萃取液完全流过后，加压排空净化柱。取 2. 5 ｍＬ 净 化 液 于 40 ℃ 水浴中氮吹至近干，用 5 ｍｍｏｌ ／ Ｌ 甲酸铵（含 0. 1％ 甲酸）－乙腈溶液（5 ∶ 5， ｖ ／ ｖ）定容至 1 ｍＬ，充分混匀后，过 0. 22 μｍ 有机相 滤膜，进样分析。

1．3 色谱－质谱条件

Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ18 柱（100 ｍｍ × 2. 1 ｍｍ，1. 9 μｍ）；柱温：40 ℃；进样量：10 μＬ。流动 相：Ａ 为 5 ｍｍｏｌ ／ Ｌ 甲酸铵水溶液，Ｂ 为乙腈－甲醇 （1 ∶1，ｖ ／ ｖ）；流速：0. 35 ｍＬ ／ ｍｉｎ。梯度洗脱条件：0 ～ 0. 8 ｍｉｎ，2％ Ｂ；0. 8～3. 0 ｍｉｎ，2％ ～24％ Ｂ；3. 0～ 4. 0 ｍｉｎ，24％ Ｂ；4. 0 ～ 6. 0 ｍｉｎ，24％ ～ 95％ Ｂ；6. 0 ～9. 0 ｍｉｎ，95％ Ｂ；9. 0 ～ 9. 5 ｍｉｎ，95％ Ｂ ～ 2％ Ｂ； 9. 5～12. 0 ｍｉｎ，2％ Ｂ。

2 结果与讨论

因为本研究所检测的真菌毒素种类较多，需要 兼顾各类目标待测物的提取效率。真菌毒素常用的 提取试剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己 烷、二氯甲烷等，考察不同提取剂对目标物的提取效 果，其中甲醇、乙腈对各种真菌毒素均有较好的提取 效率，优于其他几种提取剂。乙腈为极性较强的低 毒溶剂，具有优良的溶解性，对大多数非极性和部分 极性真菌毒素有较高的提取率，并可促使蛋白质变 性沉淀，提高提取效率，因此本研究选用乙腈（或 乙腈体系）作为提取剂。部分真菌毒素对 ｐＨ、极性 范围比较敏感，可在提取时加入辅助试剂增强联合 提取效果，研究发现乙腈作为提取剂加入甲酸 可以提高伏马毒素、赭曲霉毒素等的提取效果，经过 实验优化最终选择乙腈（含 2％ 甲酸）作为提取液， 各种目标待测物均取得了良好的提取效果。采用空白样品基质溶液准确配制不同质量浓度 的混合标准工作液，经高分辨质谱检测，以色谱峰面 积（Ｙ）为纵坐标、对照溶液的质量浓度（Ｘ，μｇ ／ Ｌ） 为横坐标绘制标准曲线。高分辨质谱使用目标物的 精确质量数提取，基线噪音很低，信噪比往往无穷 大，因此不采用以 3 倍信噪比（Ｓ ／ Ｎ）确定化合物检 出限、10 倍信噪比确定化合物定量限（ＬＯＱ）的方 法，而是用向空白样品中逐级降低加标浓度，以各目 标物在线性范围中满足回收率值在 60％ ～ 120％ 区 间内的最低浓度为方法的定量限。结果表明，20 种 真菌毒素在相应浓度范围内呈良好的线性关系，相 关系数（ｒ2 ）均＞0. 99，定量限为 0. 25 ～ 20 μｇ ／ ｋｇ，可 满足检测要求。

3 结论

利用高效液相色谱－四极杆／ 静电场轨道 阱高分辨质谱，快速筛查和确证了粮谷产品中 20 种 真菌毒素。高分辨质谱保证了复杂样品中基质干扰 的消除，显著提高了目标物定性和定量结果的准确 性。该方法快速、灵敏、准确，可满足粮谷产品中真 菌毒素的大通量快速筛查和确证。