其林贝尔分析大鼠体内的药代动力学影响

葛根素是野葛的主要成分，主要用于高血压和冠 心病 等 的 治 疗。葛根素难溶于水，生物 利 用 率 低。甘草的主要活性成分是甘草酸，甘草酸有 2 种 构型，即 18α － 甘草酸和 18β － 甘草酸。本实验 研究这 2 种构型的甘草酸对葛根素在大鼠体内药代动力学的影响。

材料与方法

1 材料

动物 雄性 SD 大鼠，体重 180 ～ 200 g，由北京维 通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证号: SYXK( 冀) 2005 － 0038。 药品与试剂 葛根素对照品，规格: 每支 20 mg， 批号: 110752 － 200809，由中国食品药品检定研究院 提供; 肝素钠注射液，规格: 每支 2 mL /1. 25 × 104 U， 批号: 20100416，江苏万邦生化有限公司生产; 18 － α 甘 草 酸 和 18 － β 甘 草 酸，纯 度: ≥ 90% ，批 号: 20100321，南京泽朗药业有限公司生产。甲醇，美国 Fisher Chemicals 公司生产; 羧甲基纤维素钠，国药集 团化学试剂有限公司生产。 仪器 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品; 旋涡混合器VORTEX-5，海门市其林贝尔产品。

2 实验方法

2. 1 葛根素血药浓度方法的建立

2. 1. 1 色谱条件

色谱柱: Diamonsil C18 ( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ， 流动相: 甲醇 － 水( 30∶ 70) ，检测波长: 250 nm，流速: 1. 00 mL·min － 1，柱温: 30 ℃，进样量: 10 μL。

2. 1. 2 对照品溶液的制备

将葛根素对照品 4 mg 置于 50 mL 的容量瓶中， 加甲 醇 溶 解 并 稀 释 至 刻 度，摇 匀，制 成 浓 度 为 80 μg·mL － 1对照品储备液备用。

2. 1. 3 标准曲线的制备

取上述储备液，用甲醇配制成质量浓度为 2，4，8，16，20，40，80 μg·mL － 1的系列标准溶液。取上述系 列标准溶液 10 μL，分别加入大鼠空白血浆 200 μL， 得到质量浓度分别为 0. 1，0. 2，0. 4，0. 8，1. 0，2. 0， 4. 0 μg·mL － 1的标准血浆样品系列。按照“血浆预处 理方法”进行处理，然后将处理好的上述血浆样品依 次进样 10 μL，测定峰面积。以峰面积( Y) 对血浆浓 度( X) 进行线性回归，建立标准曲线。

2. 1. 4 专属性取空白血浆加入葛根素对照品储备液

制成葛根 素的血浆样品，按“血浆预处理方法”进行处理后，在 上述色谱条件下分别进样观察。

2. 1. 5 精密度与回收率

取上述对照品储备液分别配制成 3 种质量浓度 ( 0. 1，0. 8，4. 0 μg·mL － 1 ) 的葛根素样品溶液，按照 “血浆预处理方法”进行处理后，分别进样 10 μL，测 定峰面积，分别于日内进样 5 次，考察日内精密度; 每 天同一时间进样 1 次，共进样 5 d，考察日间精密度。 另取血浆样品，分别配制成 3 种质量浓度( 0. 1，0. 8， 4. 0 μg·mL － 1 ) 的葛根素样品溶液，按照“血浆预处理 方法”进行处理后，分别进样测定峰面积，以两者峰面 积相比，计算出葛根素在血浆提取中的绝对回收率。

2. 1. 6 稳定性实验

取大 鼠 空 白 血 浆 2. 0 mL，加入质量浓度为 0. 1 mg·mL － 1葛根素甲醇溶液 20 μL，血浆中葛根素 的质量浓度为 1. 0 μg·mL － 1，平行取 8 份，于 － 20 ℃ 冷冻保存。分别于 0，12，24，48，72，120，144，168 h， 按“血浆样预处理方法”处理样品，进行 HPLC 测定。

2. 2 动物实验

2. 2. 1 分组、给药与取样

按照体重将雄性 SD 大鼠随机分为 3 组: 联合 α 组、联合 β 组和葛根素组，每组 7 只。 联合 α 组灌胃甘草酸二铵，联合 β 组给予甘草酸 单铵，给药量为 150 mg·kg － 1，给药诱导 7 d; 葛根素组 自由进食，第 7 天 3 组均灌胃葛根素 100 mg·kg － 1。00 min，于大鼠眼球后静脉丛取血。

2. 2. 2 血浆样品预处理方法的确定

将大鼠全血置于涂有肝素抗凝剂的离心管中，以 1. 2 × 104 r·min － 1离心 5 min。取上清 200 μL，置于 1. 5 mL 的离心管中，加入甲醇 800 μL，密塞。经 0. 45 μm 的微孔滤膜过滤后，取上清液。

3 统计学处理

用 3P97 药代动力学软件进行分析，计量资料以 x珋± s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用 LSD 检验。

结 果

1 方法学评价

1. 1 专属性

葛根素与内标的保留时间分别为 13. 34 和 5. 91 min，表明血浆中内源性物质不干扰葛根素和内标的 测定。结果见图 1。

1. 2 标准曲线方程

Y = 38. 26X + 0. 97，r = 0. 999 5。葛根素血浆质量 浓度在 0. 1 ～ 4. 0 μg·mL － 1内线性关系良好。

1. 3 精密度与回收率

结果见表 1，表明该方法可满足生物样品分析 要求。1. 4 稳定性 在 － 20 ℃、7 d 内，葛根素在大鼠血浆中，含量几 乎无变化，说明葛根素在大鼠血浆中的稳定性好。

2 药代动力学参数

葛根素、联合 α 组和联合 β 组的大鼠体内药代动 力学过程均符合两房室模型。联合 α 组与葛根素组 比较，AUC、t1 /2α、t1 /2β和 Cmax均明显增加，差异均有统 计学意义( 均 P ＜ 0. 05) ; 联合 β 组与葛根素组比较， AUC、t1 /2α、t1 /2β和 Cmax均明显降低，差异均有统计学意 义( 均 P ＜ 0. 05) 。结果见表 2。



讨 论

本实验中，血浆样品经多次实验，最后选用甲醇 来沉淀血浆中的蛋白，葛根素提取率较高，处理后的 血浆样品可直接进样测定; 同时，血浆中内源性物质 及代谢物产物对葛根素的测定不干扰，具有专属性 高、准确度好、回收率高和简便快速的特点，可用于葛 根素药代动力学的研究。