析奈非那韦抗多发性骨髓瘤作用(涡旋振荡器使用

奈非那韦( nelfinavir) 是 HIV 蛋白酶的选择 性、竞争性可逆抑制剂，广泛用于艾滋病的治疗。 目前研究表明，奈非那韦还可以诱导内质网应激、 自噬和细胞凋亡，延缓癌细胞生长，能够抑 制 MM 细胞活性，与硼替佐米联合用药已用于 MM 临床试验。但是其抗 MM 作用靶蛋白 还不明确，作用机制尚未得到解析。

1 仪器与材料

 CO2 细胞培养箱( 美国 Thermo 公司) ，冷冻 离心机( 美国 Thermo 公司) ，磁珠分离装置( 上海 羧菲生物医药科技有限公司) ，小型高速离心机 ( 美国 Thermo 公司) ，超声清洗仪( 昆山市超声仪 器有限公司) ，旋转培养器( 海林市其林贝尔仪器 制造有限公司) ，涡旋振荡器( 海林市其林贝尔仪器制造有限公司) ，Q Exactive 质谱仪( 美国 Thermo Fisher 公司) ，电子天平( 梅特勒 托利多仪器 ( 上海) 有限公司) ，金属浴( 杭州博日科技有限公 司) ，电泳设备( 美国 Bio-Ｒad( 伯乐) 公司) 。 MM. 1S 细胞( 美国模式培养物集存库，American type culture collection，ATCC ) ，ＲPMI1640 培养基( 通用电气医疗集团生命科学部，GE Healthcare Life Science) ，胎牛血清( 浙江天杭生 物科技有限公司) ，NP-40 裂解液( NP-40 LysisBuffer，上海阿拉丁生化科技股份有限公司) ，环 氧基磁珠( 日本 Tamagawa Seiki 公司，TAS8848 N1110) ，奈非那韦( 美国 Med Chem Express LLC 公司) ，银染试剂盒( 北京索莱宝科技有限公司) ， DMF ( N，N-dimethylformamide，N，N 二甲基甲酰 胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司) ，无水碳 酸钾( 成都市科隆化学品有限公司) ，胰蛋白酶 ( 普洛麦格北京生物技术有限公司) 。 

2 方法

 2. 1 细胞培养和蛋白质提取

 使用含胎牛血清体积分数为 10% 的胎牛血 清( fetal bovine serum，FBS) 的 ＲPMI-1640 培养 基，将 MM. 1S 细胞培养于体积分数为 5% 的 CO2 细胞培养箱( 37 ℃ ) 。待其长到对数生长期，取 4 × 107 个 MM. 1S 细 胞，加 NP-40 裂 解 液 裂 解 20 min，以离心力 12 000 × g 离心 15 min，留取上 清溶液，得到蛋白质裂解产物，参考已报道的研究方法，进行后续实验。 

2. 2 环氧基磁珠与奈非那韦偶联

 利用 DMF 溶解奈非那韦，与环氧基磁珠混 合，加入无水碳酸钾( 作为催化剂，促进环氧基磁 珠和奈非那韦的羟基基团反应，形成化学键) ，奈 非那韦终浓度分别为 0、2、10、50 mmol·L － 1 ，在金 属浴中充分反应 20 h( 60 ℃ ) ，使奈非那韦与带有 环氧基端的磁珠偶联，成为结合紧密的磁珠 配基 化合物。 

2. 3 捕获奈非那韦作用蛋白

 将“2. 2 ”条 中 磁 珠 奈 非 那 韦 偶 联 物 和 MM. 1S 细胞蛋白裂解物共孵育。在 旋 转 器 上 ( 4 ℃ ) 孵育4 h。利用磁珠分离器分离磁珠，加入 100 mmol·L － 1 氯化钾缓冲液清洗 3 次，最后用 1 × SDS-PAGE上样缓冲液解离结合紧密的蛋白质。

 2. 4 SDS-PAGE 电泳与银染鉴定

 将“2. 3”条中解离的蛋白质溶液进行 SDSPAGE 电泳( 恒电流30 mA) 。电泳结束后，对 PAGE 胶进行银染分析: 先在固定液中固定30 min，然后加 入敏化液，室温条件下作用 30 min; 再将敏化的 PAGE 胶浸没在银染液中，室温震荡摇晃 40 min， 确保 其 充 分 染 色。最后在显色液 中显色约 10 min，加入终止液，观察条带的分布情况。

 2. 5 蛋白质质谱鉴定 

取 0 mmol·L － 1 ( 空白磁珠结合蛋白) 和 50 mmol·L － 1 ( 50 mmol·L － 1 奈非那韦结合蛋白)的 PAGE 胶条，经过还原和烷基化处理后，加入胰 蛋白酶酶解 20 h( 37 ℃) 。酶解后用 C18柱子除盐， 除盐多肽冻干后用 Loading buffer( 含甲酸、乙腈) 溶解后，使用质谱仪对酶解后样品进行鉴定，最后 采用 MASCOT 等质谱匹配软件对数据进行分析， 获得环氧基磁珠偶联蛋白质的定性鉴定信息。

 2. 6 生物信息学分析

 通过 GO 数据库和 KEGG 数据库对奈非那 韦作用蛋白进行生物信息学分析: 采用 GO 功能 注释，从生物学过程、细胞定位和分子功能 3 个方面，描述奈非那韦作用蛋白可能行使的分子 功能、细胞定位和参与的生物学过程。再将奈非 那韦作用蛋白代入 KEGG 数据库，研究其可 能参与的代谢通路以及相关疾病信息。

3 结果

SDS-PAGE 电泳后，将 PAGE 胶进行银染分 析，如图1所示，相较于前3条泳道( 空白磁珠结合蛋白、2 mmol·L － 1 奈非那韦偶联磁珠结合蛋 白、10 mmol·L － 1 奈非那韦偶联磁珠结合蛋白) ， 第 4 泳道( 50 mmol·L － 1 奈非那韦偶联磁珠结合 蛋白) 可见明显蛋白条带。上述结果说明利用环 氧基磁珠偶联奈非那韦，能捕获该化合物特异作 用蛋白，提高了蛋白鉴定结果和生物信息学分析 的可信度。相比空白磁珠，奈非那韦捕获的蛋白 更具有多样性和特异性，同时提示: 后续蛋白质谱 鉴定分析应将空白磁珠测定数据作为本底予以 扣除。

4 讨论 

采用磁珠分离法捕获奈非那 韦作用蛋白，相对于其他捕获靶蛋白的方法，此方 法更简单、高效、易于自动化。通过磁珠与药物某 个特定基团反应，将药物与磁珠偶联，再与蛋白孵 育，捕获药物作用的靶蛋白。由于奈非那韦已在 MM 治疗中突显前景，本研究中，作者利用质谱技 术将环氧基磁珠 奈非那韦结合物捕获的蛋白 ( 来源于 MM. 1S 细胞) 进行蛋白鉴定，根据可信 度筛选出 3 个与肿瘤活性相关的蛋白: L 乳酸脱 氢酶、ＲPS3 和 VDAC1。L 乳酸脱氢酶会促进癌 细胞的糖酵解过程，使葡萄糖转化为乳酸盐，为肿 瘤细胞的生长繁殖提供能量，血清中 L 乳酸脱氢 酶水平可以作为预测晚期癌症患者生存时间的有 效指标; 研究结果显示，ＲPS3 蛋白是恶性肿瘤 的指标，是重要的促肿瘤发生因子; 含量较高 的 VDAC1 作为代谢物转运体参与了癌细胞的代 谢，其表达与癌细胞侵袭相关。据此推断 L 乳酸脱氢酶、ＲPS3 和 VDAC1 可能与奈非那韦抗 MM 作用有关，为确定奈非那韦抗 MM 作用机制 提供理论依据。

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