蒙药巴特日七对小鼠胶质瘤的治疗作用

恶性胶质瘤发病快，70% ～80%的患者多在发病 半年之内确诊 。随着医疗技术及新药研发加 快，针对胶质瘤的治疗手段取得较大进步，疗效亦有 明显提升，但现实仍然面临诸多挑战，胶质瘤患者的 预后和存活依然没有得到显著改善，加强胶质瘤 发病机制研究和治疗方法探索显得极为紧要，开发 新的药物用于治疗胶质瘤对于提高患者疗效和预后 具有重要意义，蒙药巴特日七又名为巴布敦朱日，是蒙医临床上治疗黏热症及肠刺痛的最常用方剂。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

U251 胶质瘤细胞购自中国科学院 上海生物学研究所。SPF 级雄性 C57BL /6 小鼠，来 源北京维通利华动物实验中心。

1. 2 试剂

巴特日七味丸( 内蒙古蒙药股份有限 公司) 。胎牛血清购自 Gibco 公司，DMEM 培养基、 胰蛋白酶购自美国 Invitrogen 公司，PAMAM 和 FA 购自美国 Sigma 公司。兔抗小鼠的高迁移率族蛋白 ( HMG) B1、Toll 样受体( TLＲ) 4、核因子( NF) -κB 和 β-actin 多克隆抗体购自美国 Abcam 公司; 辣根过氧 化物酶耦联山羊抗兔 IgG 购自北京中杉金桥生物技 术有限公司; 聚偏氟乙烯( PVDF) 、聚氰基丙烯酸正 丁酯( BCA) 蛋白定量试剂盒、电光学发光( ECL) 显 色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。ＲIPA 裂 解液、Trizol 试剂盒、逆转录试剂盒购自天根生化科 技北京有限公司) ，SYBＲ Premix Ex TaqTM Ⅱ购自 宝日生物技术北京有限公司，引物由上海生工生物 合成，Applied Biosystem 7500 快 速 荧 光 定 量 PCＲ 仪。垂直电泳槽和电转仪购自北京六一仪器厂，水平摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 小鼠胶质瘤模型构建

取对数生长期 U251 细胞，胰蛋白酶消化，离心去上清，计算细胞数，磷酸 盐缓冲液( PBS) 重悬，置于 37℃ 水浴备用。麻醉小 鼠，将小鼠固定于立体定向仪上，剪去头顶部眼裂至 外耳道之间的毛发，常规消毒铺单，于中线处眼裂后 作一长 约1. 0 cm 垂 直 切 口，暴 露 前 囟，取 其 前 方 1. 0 mm，右侧距中线 1. 0 mm 处钻孔，其直径约为 1. 0 mm，用微量注射器吸取 4 μl 细胞悬液，调整移 动架位置，使针尖位于骨孔处，缓慢垂直进针，持续 注射 10 min，缓慢拔针，以骨蜡封闭骨窗，逐层缝合 关颅，固定于电极移动架上。正常饲养( 57BL /6 小 鼠作为对照组) 。

1. 3. 2 治疗方法

将模型分为四组: 对照组注射无 菌生 理 盐 水; 低剂量治疗组注射巴特日七味丸 20 mg /kg; 中剂量治疗组 注射巴特日七味丸 40 mg /kg; 高剂量治疗组 注射巴特日七味丸80 mg /kg，每组 20 只。每天灌胃给药 1 次，每隔 1 d 测量肿瘤变化，治疗 12 d，脱臼处死，取肿瘤组织，并 取出肿瘤称重记录，计算肿瘤体积，计算抑瘤率，体 积抑瘤率( %) = ( 实验组平均瘤体积/模型组平均瘤 体积) ×100%。肿瘤组织一部分用甲醛溶液保存， 一部分放入液氮保存。本实验经伦理委员会批准。

1. 3. 3 肿瘤组织细胞凋亡情况

TUNEL 法检测肿 瘤细胞凋亡情况，将制备好石蜡切片按试剂盒说明 书进行操作，于光镜下观察，若细胞核内为棕黄色即 为阳性细胞。随机选择并计算 5 个高倍视野中凋亡 指数( AI) 。AI = ( 凋亡细胞数/细胞总数) ×100%。

1. 3. 4 Western 印迹检测

HMGB1、TLＲ4、NF-κB 蛋 白 水 平 解 冻 组 织，加 ＲIPA 裂 解 液 裂 解， 12 000 r/min，4℃，离心 30 min，取上清。采用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，上样 50 g，根据浓度 计算各个样品所需体积，按 1 ∶5加上样缓冲液，随后 进行 电 泳，电 泳 完 成 后，切 胶。随 后 进 行 转 膜， 200 mA，120 min。5%的脱脂牛奶封闭，室温水平摇 床 2 h。用封闭液稀释相应的 HMGB1、TLＲ4 和 NF-κB一抗，使 PVDF 膜浸泡于 TBST 中，4℃ 孵育过 夜。PBST 洗 3 次，每 次 5 min，辣根过氧化物酶 ( HＲP) 标记二抗按 1 ∶50 000 稀释，孵育 HＲP 标记 的二抗，PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵 育 2 h。TBST 清洗 PVDF 膜 3 次，5 min /次。加入 ECL 底物液，孵育 3 min。放入显影液显影、定影液 定影。采用 IMAJ 软件对目标图像进行灰度值分 析，并进行统计学分析。

2 结 果

TUNEL 法检测结果显 示，模 型 组 AI 为 〔( 10． 64 ± 1． 36) %〕，与 对 照 组 〔( 41．25±5．16) %〕相比，明显降低( P＜0．05) ，蒙药 巴特日七治疗后，AI 明显增加，且随着剂量的增加， AI 增加越明显〔低剂量组( 18．13±2．29) %，中剂量 组( 25．36±3．15) %，高剂量组( 33．52±4．28) %，P＜0． 05〕。ＲT-qPCＲ 结果结果显示，与模型组相比，HMGB1、TLＲ4、NFκB mＲNA 表达水平明显增加( P＜0．05) ，蒙药巴特 日七治疗后三种 mＲNA 明显减弱，且随着剂量增 加，mＲNA 减 弱 越 明 显，呈现剂量效应关 系 ( P ＜ 0．05)。

3 讨 论

胶质细胞瘤在手术中彻底切除肿瘤存在较大困 难。故胶质瘤复发率高和预后较差。放化疗法能够 杀死胶质瘤细胞，但其不具特异性，故会造成严重副 反应，目前尚不明确发病机制，临床上尚未具备根本 治疗的方法。因此，寻找新的有效的治疗药物仍然 至关重要 。蒙药治疗肿瘤具有独特优势，用药 少，其疗效好且安全性较高，且毒副作用低等优点， 在抗肿瘤作用机制的研究逐渐成为医学热点。蒙药 巴特日七味丸具有清热解毒、消黏的功效，为肠道及 黏热症的常用主方，邓秀玲研究显示蒙药巴特日 七能抑制 MGC-803 细胞的增殖。研究发现，蒙药巴 特日七味丸呈现剂量效应关系地抑制裸鼠移植瘤的 生长 。肿瘤细胞之所以可无限增殖和生长。

 

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