牛瘤胃乳酸片球菌的分离鉴定（QL-861使用）

乳酸菌作为一种重要的肠道微生物菌群在动物 胃肠道内发挥重要作用。大量研究显示，乳酸菌在肠 道内发酵过程中能产生大量乳酸、乙酸及其他挥发性 脂肪酸，从而调控动物胃肠道内的 pH 值，以提高铁、 磷、钙等多种微量元素的吸收和利用。除此之外， 乳酸菌可利用糖类发酵产生大量有机酸，对维持动物 胃肠道内的微生物区系平衡和保护动物消化机能具 有不容忽视的作用; 动物胃肠道内的乳酸菌群可对多 种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生明显的抑制作 用，并激活巨噬细胞、NK 细胞和 B 淋巴细胞，从而增 强机体的免疫功能。

1 材料 

1. 1 样品

成年牛瘤胃，由黑龙江八一农垦大学生命科学与 技术学院提供。

1. 2 主要试剂

MＲS 固体/液体培养基，购自北京奥博星生物技 术有限责任公司; 乳酸菌生化鉴定管，购自青岛高科 技工业园海博生物科技有限公司。

1. 3 主要仪器

洁净工作台( 型号为 BCN－1360B) ，购自哈尔滨 市东联电子技术有限公司; 恒温摇床( 型号为 BSD－ YX3600) ，购自上海旻泉仪器有限公司; 电子精密天 平( 型号为 JA2003N) ，购自上海佑科仪器仪表有限 公司; 台式离心机( 型号为 TDL－5－A) ，购自上海飞 鸽仪器有限公司; 生物显微镜( 型号为 DM2500) ，购 自北京悦昌行科技有限公司; 电热恒温培养箱( 型号为 DＲP－9082) ，购自上海森信实验仪器有限公司; 超 低温 冰 箱［型 号 为 MDF － 382E ( N) ］，购 自 日 本 Hitachi 公司; 电热恒温水浴锅( 型号为 HWS12) ，购 自上海一恒科学仪器有限公司; 旋涡振荡器( 型号为 其林贝尔QL－861) ，购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司; 精密 pH 计( 型号为 PHS － 3C) ，购自上海雷磁仪器 厂; 多 功 能 酶 标 仪 ( 型 号 为 TECAN Infinite M200PＲO) ，购自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 菌株的分离纯化与形态观察

从瘤胃内层取样，将样品剪碎置无菌生理盐水中， 离心获取上清液。按照 1 ∶ 100 比例稀释上清液，均匀 涂布于 MＲS 固体培养基中，37 ℃恒温培养 24 h，挑取 生长状态良好的单个菌落，反复划线分离至获得纯菌 株，将其命名为 Y－A－2。观察菌落形态，并且进行革 兰氏染色，使用生物显微镜观察细菌形态及颜色。

2. 2 生化试验

采用直接接种法。从 MＲS 固体培养基中挑取已 纯化培养的 Y－A－2 菌株接种于生化鉴定管中，用封 口膜封口。除 1%马尿酸钠的培养条件和培养时间 为 37 ℃ 水浴 2 h 外，其他试剂七叶苷、纤维二糖、麦 芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳 糖均为 37 ℃培养 24 ～ 48 h。根据生化鉴定管的颜色 变化来判断乳酸菌的发酵情况: 七叶苷，阳性为黄色或 黑色，阴性为紫色或紫灰色; 纤维二糖、麦芽糖、甘露 醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖，阳性为 黄色，阴性为紫色或紫灰色; 1%马尿酸钠，阳性为深 紫色，阴性为淡紫色或无色。

2. 3 16S rＲNA 序列比对与分析

在形态分析和生化试验基础上，委托吉林省库美 生物科技有限公司合成乳酸菌通用引物，序列为 27F 5' － AGAGTTTGATCMTGGCTCAG － 3' 和 1492Ｒ 5' － TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3'，挑取已纯化培养 的 Y－A－2 菌株接种于 MＲS 液体培养基中进行扩增， 委托吉林省库美生物科技有限公司对其进行 16S rＲNA 序列检测，将所得测序结果输入 GenBank 中对 其进行同源性比对分析。

2. 4 生物学特性研究

2. 4. 1 最适温度的测定

在 MＲS 液体培养基和振 荡速度相同的情况下，挑取 Y－A－ 2 纯菌株接种到 7 支试管中，然后分别于 16，23，30，37，44，51，58 ℃ 温度条件下摇床培养 24 h，测定其 OD600值并记录，重 复 3 次。从 7 个温度中选取最优温度采用二分法 ［( X±7) ，( X±3) ，( X±1) ℃，］进行再次测量，直至得 到最适温度并记录，重复 3 次。

2. 4. 2 生长曲线的绘制

挑取 Y－A－2 纯菌株接种 到试管中，在最适温度条件下，24 h 内每隔 2 h 测定 该菌的 OD600值 1 次并记录，重复 3 次。2. 4. 3 pH 值的测定 挑取 Y－A－2 纯菌株接种到试 管中，在最适温度条件下，24 h 内每隔 2 h 测定该菌 的 pH 值 1 次并记录，重复 3 次。 2. 4. 4 耐盐性试验将 MＲS 液体培养基中的盐浓 度分 别 调 节 至 1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、 11. 5%，每支试管分装 3 mL，每管接种菌液 120 μL， 37 ℃厌氧培养 24 h，记录 OD600值，重复 3 次。 2. 4. 5 耐酸碱试验 将 MＲS 液体培养基的 pH 值调 节 至 1. 5，3. 5，5. 5，7. 5，9. 5，11. 5，每 支 试 管 分 装 3 mL，每管接种菌液 120 μL，37 ℃ 厌氧培养 24 h，记 录 OD600值，重复 3 次。 

3 结果与分析

用接种针从 MＲS 固体培养基上挑取已纯化培养 的同一菌落接种于生化鉴定管中，置( 36 ± 1) ℃ 温箱 中恒温培养 36 h 后对比颜色得出结果。从糖发酵试 验中得知，该菌株可以发酵纤维二糖、水杨苷、菊糖。 生化试验结果。厌氧培养 24 h 后可见菌落分散，菌落呈圆形，中 等大小，凸起，湿润，边缘整齐，直径为( 3± 1) mm，菌 落正面为乳白色，背面为黄色。多 次重复划线分离纯化菌株，对纯化后的菌株进行革兰 氏染色，可见该菌株为革兰氏阳性、菌体单独排列或 以小群聚集生长，菌体呈球状。初 步判定此菌株为革兰氏阳性球菌。

4 结论

本试验从牛瘤胃中分离纯化出 Y－A－2 菌株，对 该菌进行菌落形态观察、生化试验和 16S rＲNA 序列 同源性分析鉴定，确定 Y－A－2 菌株为乳酸片球菌。 生物学特性研究结果显示，Y－A－2 菌株的最适生长 温度为 26 ℃，相比于其他同种菌株，24 h 内生长较为 缓慢，具有一定的耐盐能力，不耐强酸强碱。

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