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牛瘤胃乳酸片球菌的分离鉴定(QL-861使用)

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-19 09:52【

乳酸菌作为一种重要的肠道微生物菌群在动物 胃肠道内发挥重要作用。大量研究显示,乳酸菌在肠 道内发酵过程中能产生大量乳酸、乙酸及其他挥发性 脂肪酸,从而调控动物胃肠道内的 pH 值,以提高铁、 磷、钙等多种微量元素的吸收和利用。除此之外, 乳酸菌可利用糖类发酵产生大量有机酸,对维持动物 胃肠道内的微生物区系平衡和保护动物消化机能具 有不容忽视的作用; 动物胃肠道内的乳酸菌群可对多 种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生明显的抑制作 用,并激活巨噬细胞、NK 细胞和 B 淋巴细胞,从而增 强机体的免疫功能。


1 材料 


1. 1 样品

成年牛瘤胃,由黑龙江八一农垦大学生命科学与 技术学院提供。

1. 2 主要试剂

MRS 固体/液体培养基,购自北京奥博星生物技 术有限责任公司; 乳酸菌生化鉴定管,购自青岛高科 技工业园海博生物科技有限公司。

1. 3 主要仪器

洁净工作台( 型号为 BCN-1360B) ,购自哈尔滨 市东联电子技术有限公司; 恒温摇床( 型号为 BSD- YX3600) ,购自上海旻泉仪器有限公司; 电子精密天 平( 型号为 JA2003N) ,购自上海佑科仪器仪表有限 公司; 台式离心机( 型号为 TDL-5-A) ,购自上海飞 鸽仪器有限公司; 生物显微镜( 型号为 DM2500) ,购 自北京悦昌行科技有限公司; 电热恒温培养箱( 型号为 DRP-9082) ,购自上海森信实验仪器有限公司; 超 低温 冰 箱[型 号 为 MDF - 382E ( N) ],购 自 日 本 Hitachi 公司; 电热恒温水浴锅( 型号为 HWS12) ,购 自上海一恒科学仪器有限公司; 旋涡振荡器( 型号为 其林贝尔QL-861) ,购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司; 精密 pH 计( 型号为 PHS - 3C) ,购自上海雷磁仪器 厂; 多 功 能 酶 标 仪 ( 型 号 为 TECAN Infinite M200PRO) ,购自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 菌株的分离纯化与形态观察

从瘤胃内层取样,将样品剪碎置无菌生理盐水中, 离心获取上清液。按照 1 ∶ 100 比例稀释上清液,均匀 涂布于 MRS 固体培养基中,37 ℃恒温培养 24 h,挑取 生长状态良好的单个菌落,反复划线分离至获得纯菌 株,将其命名为 Y-A-2。观察菌落形态,并且进行革 兰氏染色,使用生物显微镜观察细菌形态及颜色。

2. 2 生化试验

采用直接接种法。从 MRS 固体培养基中挑取已 纯化培养的 Y-A-2 菌株接种于生化鉴定管中,用封 口膜封口。除 1%马尿酸钠的培养条件和培养时间 为 37 ℃ 水浴 2 h 外,其他试剂七叶苷、纤维二糖、麦 芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳 糖均为 37 ℃培养 24 ~ 48 h。根据生化鉴定管的颜色 变化来判断乳酸菌的发酵情况: 七叶苷,阳性为黄色或 黑色,阴性为紫色或紫灰色; 纤维二糖、麦芽糖、甘露 醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖,阳性为 黄色,阴性为紫色或紫灰色; 1%马尿酸钠,阳性为深 紫色,阴性为淡紫色或无色。

2. 3 16S rRNA 序列比对与分析

在形态分析和生化试验基础上,委托吉林省库美 生物科技有限公司合成乳酸菌通用引物,序列为 27F 5' - AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3' 和 1492R 5' - TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3',挑取已纯化培养 的 Y-A-2 菌株接种于 MRS 液体培养基中进行扩增, 委托吉林省库美生物科技有限公司对其进行 16S rRNA 序列检测,将所得测序结果输入 GenBank 中对 其进行同源性比对分析。

2. 4 生物学特性研究

2. 4. 1 最适温度的测定

在 MRS 液体培养基和振 荡速度相同的情况下,挑取 Y-A- 2 纯菌株接种到 7 支试管中,然后分别于 16,23,30,37,44,51,58 ℃ 温度条件下摇床培养 24 h,测定其 OD600值并记录,重 复 3 次。从 7 个温度中选取最优温度采用二分法 [( X±7) ,( X±3) ,( X±1) ℃,]进行再次测量,直至得 到最适温度并记录,重复 3 次。

2. 4. 2 生长曲线的绘制

挑取 Y-A-2 纯菌株接种 到试管中,在最适温度条件下,24 h 内每隔 2 h 测定 该菌的 OD600值 1 次并记录,重复 3 次。2. 4. 3 pH 值的测定 挑取 Y-A-2 纯菌株接种到试 管中,在最适温度条件下,24 h 内每隔 2 h 测定该菌 的 pH 值 1 次并记录,重复 3 次。 2. 4. 4 耐盐性试验将 MRS 液体培养基中的盐浓 度分 别 调 节 至 1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、 11. 5%,每支试管分装 3 mL,每管接种菌液 120 μL, 37 ℃厌氧培养 24 h,记录 OD600值,重复 3 次。 2. 4. 5 耐酸碱试验 将 MRS 液体培养基的 pH 值调 节 至 1. 5,3. 5,5. 5,7. 5,9. 5,11. 5,每 支 试 管 分 装 3 mL,每管接种菌液 120 μL,37 ℃ 厌氧培养 24 h,记 录 OD600值,重复 3 次。 


3 结果与分析


用接种针从 MRS 固体培养基上挑取已纯化培养 的同一菌落接种于生化鉴定管中,置( 36 ± 1) ℃ 温箱 中恒温培养 36 h 后对比颜色得出结果。从糖发酵试 验中得知,该菌株可以发酵纤维二糖、水杨苷、菊糖。 生化试验结果。厌氧培养 24 h 后可见菌落分散,菌落呈圆形,中 等大小,凸起,湿润,边缘整齐,直径为( 3± 1) mm,菌 落正面为乳白色,背面为黄色。多 次重复划线分离纯化菌株,对纯化后的菌株进行革兰 氏染色,可见该菌株为革兰氏阳性、菌体单独排列或 以小群聚集生长,菌体呈球状。初 步判定此菌株为革兰氏阳性球菌。


4 结论


本试验从牛瘤胃中分离纯化出 Y-A-2 菌株,对 该菌进行菌落形态观察、生化试验和 16S rRNA 序列 同源性分析鉴定,确定 Y-A-2 菌株为乳酸片球菌。 生物学特性研究结果显示,Y-A-2 菌株的最适生长 温度为 26 ℃,相比于其他同种菌株,24 h 内生长较为 缓慢,具有一定的耐盐能力,不耐强酸强碱。




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