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增强卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用-TS-2000A使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-23 09:11【

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一, 且致死率较高。美国国立癌症研究院(NCI)调查 显示,卵巢癌的致死率约占女性生殖系统肿瘤死亡率 的一半。目前,对卵巢癌的手术治疗尚不十分成熟, 因为卵巢癌极易发生转移,虽然以铂类药物为主的化 疗能在一定程度上弥补手术治疗的局限,但由此引发 的化疗耐药问题已成为卵巢癌治疗的难题。


1 材料与方法 

1.1 材料 

1.1.1 药品与试剂 

虎杖苷购自上海阿拉丁生化 科技股份有限公司,批号 D1713186,纯度 ≥ 98%; MTT 粉末和二甲基亚砜购自广州赛国生物科技有 限责任公司;Annexin V-FITC 染色细胞凋亡检测试 剂盒和 JC-1 试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有 限公司;所有一抗抗体均购自美国 Cell Signaling Technology 公司;顺铂和 Hoechst33258 染色液、 小鼠抗 β-actin、山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG 均 购自上海碧云天生物技术公司。 

1.1.2 细胞 

人卵巢癌细胞系 SKOV3 购于中国 科学院典型培养物保藏委员会细胞库。 

1.1.3 主要仪器 

311 型气套二氧化碳培养箱购 自美国 Thermo Fisher Scientific 公司;CKX41 倒 置显微镜购自日本 Olympus 公司;Spectra Max Plus 384 酶标仪和 ImageXpress 高内涵成像系统购自 美国 Molecular Devices 公司;BD C6 流式细胞仪购自美国 BD 公司;TS-2000A 脱色摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司;Mini-Protean@Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印槽和 ChemiDOCTM XRS+ 分子成像系统购自美国 Bio-Rad 公司。 

1.2 方法 

1.2.1 细胞培养 

将 SKOV3 细胞以适量浓度分 别接种于培养瓶中,分别加入含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基,置于 37 ℃、5% CO2 及 95% 相对湿度的培养箱中培养。细胞呈贴壁状态生长, 每周传代 2 ~ 3 次,用 0.25% 胰酶消化 2 ~ 3 min 传代。 

1.2.2 MTT 法 

取对数生长期的 SKOV3 细胞, 0.25% 胰酶消化后制成单细胞悬液,计数,调整细 胞浓度为 5 × 104 个/ml,每孔接种 100 μl,培养 24 h。设置不同浓度的虎杖苷(10、20、40、60、 80、100 μmol/L)6 个剂量组,对照组为 RPMI1640 培养基;顺铂 5 μmol/L 与以上 6 个不同剂量的 虎杖苷联合作用,对照组为顺铂(5 μmol/L)。每 组各设 3 个复孔,给药后继续培养 24 和 48 h。 每孔加 20 μl MTT 继续培养 4 h。弃原液,每孔 加 150 μl DMSO,振荡器振荡 10 min,以 570 nm 为检测波长,630 nm 为参照波长,用酶标仪检测 各孔的吸光度(A),按下列公式计算不同浓度药 物作用后肿瘤细胞存活率:细胞存活率(%)= (A 实验组/A 对照组)× 100%。用同样的方法设置 5 个 不同浓度的顺铂(1.5、3、6.25、12.5、25 μmol/L) 给药组,对照组为 RPMI1640 培养基,给药后继 续培养 24 和 48 h,计算细胞存活率。 

1.2.3 单克隆形成实验 

取对数生长期的 SKOV3 细胞,调整细胞密度为(4 ~ 5)× 102 个/ml, 每孔 2 ml 接种于 6 孔培养板中,在培养箱中培养 至细胞贴壁,弃去原有的培养液,分别加入虎杖苷 10 μmol/L,虎杖苷 20 μmol/L,顺铂 2.5 μmol/L, 虎杖苷 10 μmol/L + 顺铂 2.5 μmol/L 以及虎杖苷 20 μmol/L + 顺铂 2.5 μmol/L,RPMI1640 培养基 组作为空白对照组,继续培养 48 h 后撤去加药的 培养基,换成正常的新鲜培养基放于 37 ℃、5 % CO2 孵箱中继续培养,且每隔 2 ~ 3 天换液,并于 光学显微镜下观察克隆的形成。大约 15 d 后,6 孔 板中出现肉眼可见的克隆时终止培养,弃去培养 液,用每孔 1 ml 的 PBS 清洗 2 次,每孔加 1 ml 的 4% 多聚甲醛固定 30 min,弃去固定液,用 PBS 清洗 2 次。每孔加入 1 ml 结晶紫染色液染 色 20 min 左右,然后用 PBS 缓慢洗去染色液,置于空气中干燥后拍照处理。 

1.2.4 Hoechst33258 观察细胞核形态 

SKOV3 细胞 1 × l05 个/孔接种于 96 孔板,置于 37 ℃、 5% CO2 及饱和湿度条件下培养,24 h 后加入虎 杖苷 20 μmol/L 以及虎杖苷 20 μmol/L + 顺铂 5 μmol/L,同时设定终浓度 < 0.1%(v/v)的 DMSO 为溶剂对照组,作用 24 h 后,取出用 PBS 清洗 细胞 2 次,然后用 4% 多聚甲醛固定 30 min,用 PBS 清洗两次,接着每孔加入 200 μl Hoechst33258 染液,终浓度为 5 μg/ml,37 ℃ 避光染色 30 min。 染色结束后用 ImageXpress 高内涵成像系统进行 拍照。


2 结果 

2.1 虎杖苷与顺铂联用对 SKOV3 细胞生长的影响

虎杖苷单独用药和 顺铂单独用药对卵巢癌 SKOV3 细胞 24、48 h 的 细胞存活率比较所示;24 h 的虎杖苷、顺铂、虎杖苷+顺铂联合组的 IC50 分别为(257.3 ± 5.9)、(14.4 ± 2.7)、(190.5 ± 7.3)μmol/L,CI50 = 1.08 ± 0.2,CI ≤ 1.1,为叠加作用;48 h 的虎杖苷、顺 铂、虎杖苷 + 顺铂联合组的 IC50 分别为(175.7 ± 6.3)、(8.8 ± 2.1)、(13.8 ± 4.5)μmol/L,CI50 = 0.68 ± 0.14,CI < 0.8,为中度协同作用。结果 表明虎杖苷与顺铂联合作用 48 h 对抑制 SKOV3 细胞生长有协同作用。 

2.2 单克隆形成实验检测细胞增殖抑制作 

显示虎杖苷与顺铂联合作用后对 SKOV3 细胞增殖的抑制作用增强。虎杖苷单独作 用卵巢癌细胞的抑制增殖作用不甚显著,但当其与 顺铂(2.5 μmol/L)联用时,20 μmol/L 的虎杖苷明 显抑制细胞增殖。


3 讨论 

卵巢癌的化疗耐药及复发转移是世界医学界 待攻克的一大难题,需要研究新药物和新的治疗策 略来改善卵巢癌的预后。许多研究表明,中药成分开发正在成为发现抗癌药物的新方法。中药虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc. 系蓼科植物,具 有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功 效。其核心成分是虎杖苷,在肿瘤治疗方面具有较 高的药用价值。我们的研究表明虎杖苷能增强卵 巢癌细胞对顺铂的药物敏感性,两者联用具有协同 作用,能使细胞凋亡增强。




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