补肾益肝活血方含药血分析-万向摇床的使用！

骨关节炎( OA) 属于中医学痹证的范畴，好发于 老年人，以软骨退变和关节周围骨质增生、细胞外基 质( ECM) 代谢失调为主要的病理特征，软骨变性是 OA 的最基本病理改变，临床上表现为关节的疼痛、 僵硬、肥大及功能活动受限等 。临床上应用补肾 益肝活血方治疗 OA 疗效显著，取得良好临床效果， 并通过实验探讨了该方对软骨细胞凋亡、骨髓基质 细胞( BMSCs) 分化的影响，发现补肾益肝活血方有 抑制软骨细胞凋亡的作用，其含药血清能有效诱导 BMSCs 成软骨细胞分化，其作用机制很可能与细胞 外信号调节激 酶 ( EＲK) 和丝裂原活化蛋白激酶( MAPKs) 存在相关联系。本研究旨在分析补肾益 肝活血方对 OA EＲK/p38MAPKs 信号通路产生的 影响，探究 OA 发生机制及 OA 治疗中的机制。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

1. 1. 1 实验动物

选取健康的、成年 SPF 级雌性 SD 大鼠，重量 185 ～ 230 g，实验用动物全部由南京 中医药大学研究所提供。为了使这些大鼠适应周围 环境，纳入本实验的所有 SD 大鼠均于实验前 1 w 放 置在实验室内，饲养员进行常规的分笼饲养。实验 室基本指标: 保持自然光照，良好的通风，室内温度 要求控制在 18. 5～23. 0℃，湿度控制在 40% ～ 70%。 实验研究期间，所有大鼠进食标准颗粒词料，并可以 自由地饮用自来水，术前 8 h 禁食水。

1. 1. 2 主要试剂、仪器与药品

胎牛血清( FBS，Gibco 公司) ; DMEM 低糖培养基( Hyclone 公司) ; 双抗混合液( 100 U/ml 青霉素、100 μg /ml 链霉素) ，10%胰 蛋白酶、0. 2%Ⅱ型胶原酶( Sigma 公司) ; 逆转录试剂盒 ( Fermentas 公司) ; 引物合成( 上海生工生物工程公司) ; 磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶 p38 抗体( Anti-pp38α，Thr180/Tyr182) 一抗( Millipore 公司) ; p38 一抗 ( Millipore 公司) 。二氧化碳培养箱、荧光倒置显微 镜、流式细胞仪、酶标仪、滤器、无菌操作台和掌上迷你离心机。补肾益肝活血方由骨碎补 15 g、丹参10 g、没 药 10 g 及怀牛膝 10 g 组成，实验所用药物由南京中医药大学附属省中西结合医院药剂科提供。

1. 2 实验动物分组

40 只雌性 SD 大鼠随机分为 4 组，即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每 组各 10 只。

1. 3 补肾益肝活血方含药血清的制备

根据人和 动物间按体表面积折算的等效剂量比率表换算，给 药组给予补肾益肝活血方 3. 2 g /( kg·d) 灌胃，对 照组则给予等量的生理盐水灌胃。各组每 12 h 灌 胃给药 1 次，连续灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁 食，末次灌药 3 h 后，麻醉 SD 大鼠，行腹主动脉采 血，静置于温度预调在 4℃ 的冰箱 4 h 后，离心机设 置 2 500 r/min 的转速，离心 25 min，分离离心所得 血清，将同组实验动物分离所得到的血清予以混合， 并在 56℃ 水浴箱内，灭活 30 min，抽滤、除菌后分 装，－20℃保存备用。

2 结 果

体外分离培 养的原代软骨细胞外观近似圆球的形状，呈悬浮状 态，折光性较好，在接种后的 12 h 左右，开始贴壁生 长，当软骨细胞在壁上生长 24 ～ 48 h，大部分软骨 细胞贴壁伸展，形状多呈现出三角形、扁平形及多角 形，部分细胞出现分裂相。甲苯胺蓝染色后可见 细胞核呈深蓝色，有 1～2 个核仁，胞质呈淡蓝色，细 胞外基质着浅蓝色。软骨细胞的胞质经异 硫氰酸荧光素( FITC) 染色后发出鲜亮的绿色荧光， 呈强阳性，细胞核区域没有着色。细胞核经 4＇，6-二 脒基-2-苯基吲哚( DAPI) 染色后激发出蓝色荧光。几乎全部细胞表达了Ⅱ型胶原， 进一步证明本实验得到了纯度很高的软骨细胞。

3 讨 论

OA 是一种退行性变的疾病，好发于老年人，据 统计，我 国 40 岁以上人群原发性 OA 患 病 率 为 46. 3% 。OA 的特征性改变是软骨的退变和关节周围骨质的增生，实验室表现为进行性的关节软骨 破坏和骨赘的形成，软骨变性是 OA 的最基本病理 改变 。OA 可同时伴有不同程度的滑膜炎症，最 终可以出现关节的疼痛、僵硬、肥大及功能活动等受到限制 。关节软骨的退变与破坏是 OA 最主要 的病理环节，软骨组织内只有一种细胞成分，就是软 骨细胞，而软骨细胞在体内不增殖 。为了本研 究的进一步进行，本研究采用体外实验的实验方法， 用 SD 雌性大鼠肋骨的软骨细胞进行体外细胞培养。