调节胆囊癌细胞活力和迁移-其林贝尔摇床的使用

胆囊癌是消化道常见恶性肿瘤，分为原发性和 继发性。原发性胆囊癌可发生于胆囊任何部位，以 胆囊底及胆囊颈多见。原发性胆囊癌的发病率 在消化道肿瘤居第 5 位。继发性胆囊癌所占极少一 部分，主要来自消化系肿瘤的侵袭与转移。近年 来，很多文献报道，黏液蛋白在炎症向肿瘤的进展过 程中起到了很重要的作用。黏蛋白 16( mucin16， MUC16) 基因是编码 CA125 的基因，是一种由各类 上皮细胞表达的高分子量糖蛋白，其在上皮细胞表 面发挥保护和修复上皮的作用。

1． 材料

人胆囊癌细胞系( GBC-SD) 细胞购自深圳市豪 地华拓生物科技有限公司( HTX1663) 。人 MUC16 质粒 购 自 上 海 泰 冷 生 物 科 技 有 限 公 司 ( TV094025001) 。PI3K 抑制剂 BKM120 购自上海 迈瑞尔化学技术有限公司( M29995) 。Lipo2000 购 自 Thermo Fisher Scientific 公司( 11668027) 。ＲPMI1640 培养基购自 GE Health 公司( SH30091) ，FBS 购自 Thermo Fisher Scientific 公 司 ( 10099-133 ) 。 MUC16、MMP-9、p-Akt、Akt，抗微管蛋白( tubulin) 抗 体购自 abcam 公司( ab1107，ab73734，EP2109Y， ab85683，ab7291) 。抗 PI3K 抗 体 购 自 CST 公 司 ( 4249) 。蛋白酶抑制剂 Cocktail ( 不含 EDTA，小片 剂) 购自 Bimake 公司( B14011) 。PBS 购自上海生 工生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 ( E607008) 。TＲIzolTM Ｒeagent 购自成都东胜科创科 技有限公司 ( 15596026) 。青链霉素混合液( ×100) 购自北京索莱宝科技有限公司( P1400) 。反转录试剂盒购自上 海海方生物技术有限公司( A0005) 。Ｒeal-time PCＲ 试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司( 600828) 。 2×SDS 蛋白电泳上样缓冲液购自北京鼎国昌盛生 物技术有限责任公司( WB-0081) 。蛋白裂解液购自 上海碧云天生物技术有限公司( P0013) 。MMP-9 和 MUC16 的 siＲNA 序列由上海生工生物工程股份有 限公司合成，序列见表 1。GAPDH、MMP-1、MMP-2、 MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Ｒeal-time PCＲ 引物由上海生工生物工程有限公司合成。 Western blotting 装 置 ( Bio-rad ) ; 酶 标 仪 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 细胞培养箱( Thermo Fisher Scientific 公 司 ) ; 生 物 安 全 柜 ( Thermo Fisher Scientific 公司) ; 微量加样器( Gilson 公司) ; 冷冻离 心机( Eppendorf 公司) ; 旋转摇床( 海门其林贝尔仪器制造有限公司) ; 脱色摇床( 北京大龙兴创实验仪 器有限公司) 。

2． 方法

维 持在补充有 2 mmol /L L-谷氨酰胺、0. 1IU /L 青霉素、100 mg /L 链霉素和 10%热灭活 FBS 的 ＲPMI1640 培养基中，并在潮湿气氛( 37 ℃，5%CO2 ) 中培 养。BKM120 以终浓度 5 μmol /L 处理人胆囊癌细 胞 GBC-SD，8 h 后 收 获 细 胞。通 过 Lipofectamine 2000 转染人胆囊癌细胞 GBC-SD。将含目的基因的 质粒与脂质体混合，静止大约 20 min 后，缓缓滴入 GBC-SD 细胞。每 106 个细胞转染 4 μg MUC16 质粒。 siMUC16 和 siMMP-9 的转染浓度为 100 nmol /L。 2. 2 ＲNA 抽取和 Ｒeal-time PCＲ: 将 GBC-SD 细胞 用细胞刮刮下，装入 1. 5 ml 的 EP 管中，用 PBS 洗 3 次。使用 Trizol 抽取 GBC-SD 的总 ＲNA。使用反转 录试剂盒将纯化好的总 ＲNA 进行反转录。再使用 GAPDH、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 和 MMP-9 的 Ｒeal-time PCＲ 引物和荧光定量 PCＲ 试剂 盒在 ABI7500 仪器上进行 Ｒeal-time PCＲ 反应，实验 重复 3 次。进行 8%或 10% SDS-PAGE 的凝 胶 电 泳，然 后 转 移 到 Immobilon-P PVDF 膜 ( 0. 45 μm 孔 径) 。将 PVDF 膜在室温下用含有 0. 01% Tween-20 和 5%脱脂奶粉的 Tris 缓冲液( 10 mmol Tris-HCl，pH 7. 5，150 mmol /L NaCl) 封闭 1 h， 然后在 4 ℃ 下与 MUC16( 鼠，1 ∶1000) ，MMP-9( 兔， 1 ∶3000) ，p-Akt ( 兔，1 ∶ 1000) ，AKT ( 兔，1 ∶ 2000) ， PI3K( 兔，1 ∶3000) ，微管蛋白( 鼠，1 ∶10 000) 抗体温 育过夜。然后将膜在室温下与缀合有 HＲP 的相应 二抗( 鼠抗兔: 1 ∶ 4000，兔抗兔: 1 ∶ 4000) 孵育 1 h。 观察特定蛋白质使用 ECL Plus Western blotting 迹检 测系统。96 孔板中分配 100 μl EC109 细胞悬浮 液( 5000 个细胞/孔) 。将板在潮湿的培养箱中预孵 育 24 h( 37 ℃，5%CO2 条件下) 。将 10 μl 不同浓度 的待测物质加入板中。将培养板在培养箱中孵育适 当的时间( 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d) 。向板的每个孔中 加入 10μl CCK-8 溶液。将培养板在培养箱中孵育 4 h。使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

3 结果

用 MUC16 质 粒 过 表 达 MUC16 蛋 白 后，通 过 Ｒeal-time PCＲ 实 验，发 现 MMPs 家 族 中 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8 与对照组差异无显 著性( P＞0. 05) ，而 MMP-9 的 mＲNA 水平明显升高， 此差异具有统计学意义( P＜0. 05) 。 2． MUC16 通过激活 PI3K /Akt 通路促进 MMP-9 的表达过表达 MUC16 后，通过免疫印迹检测发现， MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明显升高，而 Akt 蛋 白的总量无明显变化。而敲低 MUC16 后，通过免疫 印迹，发现 MMP-9、p-Akt、PI3K 的蛋白水平明显降 低，而 Akt 蛋白的总量无明显变化。在 过 表 达 MUC16 的基础上再使用 PI3K /Akt 通路的抑制剂 BKM120 处理后，通过免疫印迹检测发现，p-Akt、 PI3K、MMP-9 和 Akt 蛋白的总量无明显变化。

4 讨论 

源于胆囊上皮的胆囊癌是胆道系统中最常见 的恶性肿瘤。手术切除是目前已知的唯一确 定有效的治疗手段，但手术切除率低于 30%，只有 5. 2% ～ 22%的患者有条件施行治愈性手术。一 旦患者出现严重腹疼、黄疽、体重减轻和胆囊包块等 胆囊癌的典型症状和体征，疾病即已进入进展期，几 乎没有完全切除的可能。胆囊癌的预后极差，主 要原因是肿瘤发展迅速，在临床出现症状之前较早 发生周围组织的侵犯和肝脏及远处转移肿瘤的侵袭 转移是影响患者预后的决定因素之一，对转移的机 制和抗转移研究是近年来肿瘤学的研究热点和抗癌 治疗的突破方向。本研究中我们发现，MUC16 激活 PI3K /Akt 通路促进 MMP-9 的蛋白表达，进而 提升胆囊癌细胞 GBC-SD 的细胞活力和迁移能力。