体外诱导骨髓间充质干细胞分析-其林贝尔脱色摇

近年来，众多国内外学者纷纷指出，骨髓间充质 干 细 胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs) 在体内特定微环境或体外特定培养条件下， 可以分化为心肌样细胞，可用于心肌梗死后的 细胞移植治疗，为受损心脏的细胞重建及衰竭心脏 的功能恢复提供一种全新的治疗方法。1，25-维生 素 D3( 1，25-vitamin-D3 ) ，是维生素 D 的激素活性代 谢产 物。有 研 究 表 明，在 心 肌 细 胞 中 加 入 1，25- vitamin-D3，可以促进心肌管的形成，且其通过负调 控经典 Wnt 信号通路和上调非经典 Wnt-11 的表达 来促进心脏细胞的分化。

1. 实验动物和主要试剂

清洁级健康雄性 SD 大鼠，3 周龄，质量 25 ～ 35g，由河北北方学院动物实验中心提供( 合格证号 为: No． 11401500056665 ) ; IMDM 培 养 基 ( 美 国 Corning 公司) ; FBS( 澳大利亚 Gibco 公司) ; 1，25- vitamin-D3( 大连美仑生物技术有限公司) ; 大鼠抗 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM 7 抗体 ( 美 国 BD 公司) ; 免疫细胞化学染色试剂盒( 北京中杉金 桥生物技术有限公司) ; 荧光素标记的羊抗兔 IgG / FITC( 北京博奥森生物技术有限公司) ; 兔抗原肌球 蛋白( tropomyosin，TPM) 多克隆抗体、兔抗间隙连接 蛋白 43( connexin 43，Cx43) 多克隆抗体、兔抗心肌 肌钙蛋白 T( cardiac troponin T，cTnT) 多克隆抗体 ( 美国 Abcam 公司) ; 兔抗 β-actin 单克隆抗体( 武汉 爱博泰克生物科技有限公司) ; HＲP 标记山羊抗兔 IgG( H+L) ( 美国 KPL 公司) ; ＲNAprep Pure 培养细 胞/细菌总 ＲNA 提取试剂盒; 转录 因 子 GATA 结 合 蛋 白 4 ( GATAbinding protein 4，GATA4) 、Nkx2. 5、GAPDH 基因引 物( 大连宝生物工程有限公司) 。

2． BMSCs 的分离培养

脱颈处 死 大 鼠，置 于 75% 乙 醇 中 浸 泡 5 ～ 10 min。于超净台中无菌条件下分离四肢长骨，在含有 Pen-Strep 的 PBS 中浸洗 3 次，剪掉骨骺端，充分暴 露骨髓腔，用无血清培养基将骨髓冲到 15 ml 无菌 离心管中，常温离心，弃上清，加入 5 ml 含 15% FBS 的常规培养基，制成单细胞悬液后接种于无菌培养 瓶中，放置在 37 ℃、饱和湿度、5%CO2 的细胞培养 箱中培养。48 h 后，光学显微镜下观察细胞的贴壁 情况，并进行首次换液，弃除悬浮细胞，此后每 72 h 换液 1 次，待贴壁细胞汇合度达到 80% ～ 90%时，用 0. 25%胰蛋白酶进行消化传代，传至 2 ～ 3 代时可用 于后续实验。每天倒置相差显微镜下动态观察细胞 贴壁、形态及生长状况，并摄片。

3． BMSCs 表面抗原的鉴定

取第 3 代汇合至 80% ～ 90%的 BMSCs，弃去原 培养基，PBS 漂洗 1 次，0. 25%胰蛋白酶消化，常规 培养基终止消化后反复充分吹打，将细胞悬液移至 15 ml 无菌离心管中，常温离心，弃上清，加入 PBS 振荡、重悬、离心、漂洗 2 次，弃上清，剩余约 300 μl， 细胞重悬并计数，调整细胞浓度为 1×1010 /L，均匀 分装至 9 支 5 ml 离心管中，每管 200 μl，分别加入 CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM 7 及其同型对 照抗体，阴性对照组加入适量 PBS，混匀，4 ℃ 条件 下避光孵育 30 min，常温离心，弃上清，加入适量 PBS 漂洗、离心，弃上清后各组加入 500 μl PBS，制 成单细胞悬液，运用流式细胞仪进行检测。

4． BMSCs 的诱导及继续培养

第 2 代 BMSCs 培养 48 h 后，应用 1，25-vitaminD3 对其进行定向诱导，设 4 个浓度，分别为 3、6、12、 24 nmol /L，72 h 后更换为常规培养基继续培养，另 设 1 个 BMSCs 未诱导组，整个过程只加入常规培养 基。倒置相差显微镜下动态观察细胞形态变化及生 长状况。封闭液孵育膜 120 min; 一抗稀释液( β-actin，以 1 ∶ 10 000 的比例稀释; TPM、Cx43、cTnT，均以 1 ∶ 1000 的比例稀释) 孵育膜，4 ℃ 条件下过夜; 室温脱色摇 床上用 TBST 洗 3 次，每次 10 min; 二抗稀释液( 山 羊抗兔 IgG( H+L) ，以 1 ∶10 000 的比例稀释) ，室温 孵育膜 120 min; 室温脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)上用 TBST 洗 3 次， 每次 10 min; ECL 化学发光检测，成像仪成像; 进行 图像分析。

5 结 果 

原代细胞接种至培养瓶初期呈圆形，在培养基 中呈悬浮状态，BMSCs 在 6 ～ 8 h 后开始贴 壁，48 h 后首次换液，细胞贴壁数量明显增加; 72 h 后贴壁细胞大部分呈短梭形，圆钝的突起自部分细 胞向外周伸出，小部分细胞呈椭圆形及多边形 ; 培养 1 周的 BMSCs，细胞进一步伸展，体积增 大，呈现出多样化的形态 ; 血细胞、造血干细胞等 在 换 液、传代的过程中被逐渐清除; 1，25- vitamin-D3 诱导 4 周的 BMSCs，相邻细胞间联系紧 密，排列具有明显的方向性，部分细胞形成漩涡样结 构。不同浓度 1，25-vitamin-D3 诱导后的 BMSCs，其数量及形态存在差异。3 nmol /L 组、6 nmol /L 组和 12 nmol /L 组诱导 72 h 后，BMSCs 增殖 显著，且细胞形态明显改变，大部分已转变成类长梭 形或多边形; 24 nmol /L 组诱导 72 h 后，BMSCs 细胞 数量相对较少，形态变化不明显，与未诱导组类似， 随后则逐渐转变成长梭形及多边形。