大鼠豆蔻酰化蛋白激酶C表达的影响-QL-902使用

缺血性中风是常见的危害人类神经系统的疾病， 占脑中风比例较大。PKC-MARCKS 信号转导系统脑 缺血后被激活，豆蔻酰化蛋白激酶 C（MARCKS）在 神经功能和神经疾病中扮演重要的角色，其为蛋白 激酶 C（protein kinase C，PKC）的特异性底物蛋白。 MARCKS 能调节大脑神经元轴突生长、内吞和胞吐 及突触可塑性等基本过程，揭示 MARCKS 蛋白在一 系列生理过程是一个不可或缺的参与者，参与了大脑 皮层的发育与衰老相关的认知能力下降等过程。目 前，已知的关于 MARCKS 的调节机制均与 PKC 磷酸 化有关。

1 材料和方法

1.1 动物

健康雄性 SD 大鼠 80 只，SPF 级，体质量 250～ 300 g，黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供， 动物许可证号 SYSK（黑）2013-012。饲养于温度 （20±2）℃、相对湿度 40%～42%环境，12 h 光照， 自由摄食饮水。

1.2 药物

芪蛭胶囊（黄芪 30 g、丹参 20 g、水蛭 15 g、地 龙 15 g 等），黑龙江中医药大学附属第一医院中药房 提供，批号 170301；尼莫地平片，哈药集团三精明水 药业有限公司，批号 20180524。

1.3 主要试剂与仪器

兔抗 MARCKS（20661-1-Ap，Proteintech），兔 抗 p-MARCKS（11992，CST），山羊抗兔 IgG（H+L） HRP（天德悦 S004），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP （天德悦 S001），GAPDH 鼠单抗（天德悦 TDY042）， 超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）， HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）。涡旋振荡仪（其林贝尔 QL-902）， 离心机（Eppendorf Centrifuge 5415D），分光光度计 （Therno Scientific，NANODROP 2000），荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，ABI7500），Fresco 低 温冷冻离心机（ Thermo ）， MultiSkan3 酶标仪 （Thermo），Mini P-4 电泳槽（Cavoy）。

1.4 分组及给药

实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型 组、阳性药组和中药组，其中假手术组 6 只，其余 3 组各 24 只。根据人与动物给药剂量比例换算，大鼠 用药剂量＝人用药剂量×0.018÷200 g。中药组给予 芪蛭胶囊（2.6 mg/mL）药液灌胃，阳性药组给予尼 莫地平（3 mg/mL）药液灌胃，假手术组和模型组给 予等体积生理盐水灌胃。给药体积 10 mL/kg，每日 1 次，连续 8 d。模型组、中药组和阳性药组根据缺血 2 h 再灌注后时间不同随机分为再灌注后 6、24、72 h 和 7 d 共 4 个亚组。

1.5 造模

第 8 日给药 1 h 后开始造模。采用 Zea Longa 线 栓法制作大鼠脑缺血损伤动物模型，即大脑中动脉 阻塞模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（35 mg/kg） 麻醉，仰卧位固定，于颈部正中线处做一纵切口，分 离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内 动脉（ICA）。然后在近心端结扎 CCA、ECA，用小 动脉夹暂时夹闭 CCA 远心端近分叉部，然后在 CCA 近心端距分叉部4 mm剪一小口，将栓线插入到CCA， 轻推栓线达分叉处，松开小动脉夹，从血管分叉处进 入 ICA，从分叉处插入深度约 18 mm，于 CCA 远心 端用细线结扎，消毒后缝合伤口。术后 2 h 将栓线拔 出约 1 cm，行再灌注。假手术组大鼠不插入栓线，其 余步骤同其他组。

1.6 神经功能缺损评分

参照 Zea Longa 5 分制评分标准对成模大鼠进 行初选：无神经缺损症状，0 分；不能充分伸展左侧 前肢，1 分；行走时身体向左侧转圈，2 分；行走时身体向左侧倾倒，3 分；不能自发行走，意识水平丧 失，4 分。选取 1～3 分者，将不合格大鼠剔除，通过 随机抽样原则补齐动物数并重新造模。 1.7 标本处理 所有实验组各取 2 只大鼠行脑组织 HE 染色，脑 组织标本制作经心脏灌流。大鼠腹腔注射 10%水合氯 醛（35 mg/kg）麻醉，先灌注生理盐水约 100 mL，再 灌注 4%多聚甲醛缓冲液。灌注固定完成后，迅速剪 取大鼠头部，用弯钳小心将缺脑组织剥离，切取 2 mm2 缺血区脑组织，4%多聚甲醛缓冲液 4 ℃固定 24 h， 组织脱水、透明及浸蜡，常规脱水、石蜡包埋、切片， HE 染色。各组余下 4 只大鼠，其中 2 只用于大鼠脑 组织 Western blot 检测，另外 2 只用于大鼠脑组织 RT-PCR 检测。模型大鼠麻醉后冰上断头取脑组织， 剥离脑组织至冰上，刀片切取缺血区脑组织，置于冻 存管中液氮保存，提取总蛋白及总 RNA 备用。 1.8 Western blot 检测豆蔻酰化蛋白激酶 C 及其磷酸 化蛋白表达 将缺血区脑组织剪碎，提取总蛋白。加裂解液， 脑组织 15 000 r/min 匀浆 10 s，冰上孵育 20 min，4 ℃、 13 000 r/min 离心 20 min，取上清液，应用 BCA 法蛋 白定量，酶标仪读取 OD 值，分装后置于-80 ℃冰箱 保存。以 RIPA 调整蛋白浓度，根据目的蛋白分子量， 配制 12%分离胶，浓缩胶浓度为 5%，20 μg/孔上样， 通过预染蛋白 Marker 确定电泳停止时间，然后进行 转模和染色，观察转膜效果。用 3%BSA-TBST 稀释 MARCKS、p-MARCKS 蛋白，浓度分别为 1∶4000 和 1∶500，室温孵育 10 min，4 ℃过夜。第 2 日膜处 理后曝光，显影 2 min，定影。拍照保存图像，分析 软件测定条带光密度值，以光密度值代表蛋白的相对 表达量。

2 结果

除假手术组外，其余大鼠自缺血再灌注后 6 h 起 即有明显的神经功能缺损表现，多数大鼠出现患侧肢 体屈曲内收、双侧伸出不对称的症状，缺损症状明显 者多出现行走时向患侧转圈，症状越重则旋转直径越 小，可出现行走时追尾。模型组大鼠神经功能评分缺 血再灌注后各时间点整体水平呈下降趋势，中药组、 阳性药组较模型组整体评分降低，再灌注后 72 h 中药 组和阳性药组较模型组差异有统计学意义（P＜ 0.05），再灌注后 7 d 中药组较模型组差异有统计学意 义（P＜0.05）。

3 讨论

气虚血瘀夹痰是缺血性中风主要病因病机。气虚 为本，血瘀为标，瘀血既成，影响气生血及行血，又 使脑络瘀阻加重。血瘀是缺血性中风的病理核心，气 虚是本病的根源；痰是脏腑功能失调的一种病理产 物，亦是导致缺血性中风的基本病理因素之一。故缺 血性中风治以益气活血、祛痰通络，则血行气旺，血 足气畅，络通风消，诸症痊愈。芪蛭胶囊具有益气活 血、化瘀祛痰、通经活络功效。方中黄芪为君药，性 甘温，大补元气，气足则血生，气旺促血行；辅以水 蛭、地龙破血逐瘀、通经活络；丹参补血、活血化瘀； 水蛭、地龙与丹参等同用，旨在祛瘀通络、活血化瘀 而不伤正。诸药合用，共奏益气活血、祛瘀化痰、通 经活络功效。现代药理研究表明，黄芪具有清除自由 基、抗脂质过氧化、拮抗内皮素的释放及兴奋性氨基 酸的毒性作用；并能降低血管通透性，改善缺血后血 液流变性205；水蛭肽具有抗脑缺血、保护神经元、 减轻细胞损伤的作用221；丹参素具有抗缺血缺氧、 抗自由基、抑制细胞内钙离子升高等作用，对神经细 胞具有保护作用266；地龙活性提取物具有减少或修 复因脑缺血引起的组织损伤和增加脑血流量、减少脑 血管阻力、降低血小板黏附和抑制动物体内血栓形成 等作用281。



 

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