肺炎链球菌调理吞噬作用的比较(其林贝尔振荡器

肺炎链球菌( Streptococcus pneumonia) 是引起肺 炎、脑膜炎、中耳炎及败血症的主要病原之一，特别 在儿童和老年人中。接种疫苗是预防肺炎链球 菌相关疾病的重要手段，为了保证肺炎链球菌疫苗 的质量，WHO 建议肺炎链球菌结合疫苗的临床评价 应以型别特异性抗体水平作为第一临床终点的判断指标。

1 材料与方法

1．1 胎牛血清

5 个不同品牌的胎牛血清( 简称品 牌 1～5) 分别购自美国 Gibico 公司、Clark 公司、Corning 公司、Seropro 公司和杭州四季青公司。

1．2 菌种、细胞

13 株肺炎链球菌菌株均来自中国 医学细菌保藏管理中心。其中，CMCC( B) 33273( 1 型) 、33278( 6B 型) 、33284( 19F 型) 均为壮观霉素 ( spectinomycin) 抗性; CMCC( B) 33274( 3 型) 、33275 ( 4 型) 、33279( 7F 型) 、33279( 18C 型) 均为奥普托 欣( optochin) 抗性; CMCC ( B) 33276 ( 5 型) 、33280 ( 9V 型) 、33281( 14 型) 均为链霉素( streptomycin) 抗性，CMCC ( B) 33277 ( 6A 型) 、33283 ( 19A 型) 、 33285( 23F 型) 均为甲氧苄氨嘧啶( trimethoprim) 抗 性。HL60 细胞购自美国 ATCC( CCL-240) ，由中国 食品药品检定研究院保存并提供。

1．3 质控血清

007sp 购自英国生物制品检定所 ( National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC) ; 920 由兰州生物制品研究所有限责任 公司惠赠; 2009S 由中国食品药品检定研究院呼吸 道细菌疫苗室制备。

1．4 主要试剂及仪器

ＲPMI1640 培养基、谷氨酰 胺、Hanks 缓冲液( HBSS) 均购自美国 Gibco 公司; 二甲基甲酰胺( DMF) 购自美国 Fisher 公司; 家兔补 体由中国食品药品检定研究院呼吸道细菌疫苗室制 备; Todd Hewitt Broth、酵母粉、琼脂粉均购自美国 BD 公司; 壮观霉素、奥普托欣、链霉素、甲氧苄氨嘧 啶、2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) 均购自 Sigma 公司。显微 镜 购 自 Olympus 公 司; CO2 培 养 箱 购 自 Thermo 公司; 微孔板振荡器购自其林贝尔公司; 菌落计数器 ProtoCOL3 购自 Synbiosis 公司。

1．5 不同品牌血清用于 HL-60 分化后细胞活力的比较

培养时间相同的增殖 HL-60 细胞，取一定体 积计数，分装至 5 支离心管中，使每支离心管中有 4×107 个细胞，以离心半径 8 cm、1 500 r/min 离心 5 min; 用品牌 1 ～ 5 的胎牛血清配制用于 HL-60 分 化的细胞培养基 CM2，轻轻重悬细胞沉淀; 将体 积加至 100 mL，于 37 ℃ 0．5% CO2培养箱中培养5～ 6 d 后，以离心半径 8 cm、1 500 r/min 离心 5 min，去 上清; 分别用1×HBSS 缓冲液( 无 Ca2+ 、Mg2+ ) 和 1× HBSS 缓冲液( 含 Ca2+ 、Mg2+ ) 清洗细胞，用台盼蓝染 色记录活细胞和死细胞的数量，计算细胞活力。

1．6 不同品牌血清分化的细胞对 13 个不同肺炎链球菌血清群/型调理吞噬作用的影响

用品牌 1 配 制的 OBB 将上述不同胎牛血清分化的细胞浓度调 整为 1×107 个/mL。OPA 滴度检测采用可同时检测 4 种血清型的多型调理吞噬试验( multiplexed opsonophagocytic killing assays，MOPA) ，具体操作流程 见参考，每轮 MOPA 中的每份质控血清均 平行测定 2 次。当对照孔菌数的平均值在 70 ～ 180 CFU/spot，非特异杀菌率≤70%时，计算每份质控血 清的调理指数( opsonic index，OI) ，取平均值作为每 轮试验的结果值，重复 3 次，计算每份质控血清调理 指数的平均值和标准差。

1．7 不同品牌血清配制成 OBB 后对 13 个不同肺 炎链球菌血清群/型调理吞噬作用的比较

用品牌 1 配制的 CM2 培养基培养 HL-60 5～6 d 后，按照 1．5 项方法处理细胞，最后用不同品牌血清配成的 OBB 调整细胞浓度为 1×107 个/mL。MOPA 试验及结果 计算按照 1．6 项方法进行。

1．8 统计学分析

1．8．1 细胞活力的比较

采用 IBM SPSS Statistics 19．0 软件对数据进行统计学分析，实验数据均以 x 珋± s表示，多组间比较采用单因素方差分析 ( oneway ANOVA) ，以品牌 1 为对照，比较与其余品牌的 差异，P＜0．05 时，差异有统计学意义。

1．8．2 调理指数的计算及分析

采用 Opsotiter3 软 件计算 OI 值，实验数据均以 x 珋± s 表示。

2 结 果

品牌 1 胎牛血清分化细胞的活力最高，为86．80%; 品牌 4 分化细胞的活力次之( 76．23%) ; 品牌 2 和 3 分化细胞的活 力相近 ( 分 别 为 71． 24% 和 72．73) ; 品牌 5 分化细胞的活力最低( 64．80%) 。与品 牌 1 胎牛血清分化细胞的活力相比较，品牌 2、3、4 分 化细胞的活力，差异均无统计学意义( P 值分别为 0．129、0．186、0．440，P＞0．05) ，而品牌 5 分化细胞的活 力，差异有统计学意义( P= 0．023，P＜0．05)。

3 讨 论

为保证疫苗质量，所有肺炎链球菌疫苗上市前 均需进行免疫保护效力测定。肺炎链球菌疫苗的保 护机制主要是通过特异性抗体介导的调理吞噬作用 将体内的肺炎链球菌清除。通过 OPA 检测抗体的 调理吞噬活性，能够直接反映功能性抗体含量，实现 对疫苗保护效力的准确评估。OPA 技术在国内 外疫苗监管体系中受到越来越多的重视，2013 年美 国惠氏公司的 13 价肺炎链球菌结合疫苗在欧洲被 批准用于 50 岁以上成人使用时，采用 OPA 技术进 行临床效果评价; 2015 年美国默沙东公司新注册的 15 价肺炎链球菌结合疫苗使用 OPA 进行了临床评价; 近年来，我国新药评审机构要求肺炎链球菌 疫苗上市前需对一定比例的临床样本采用 OPA 进 行临床效果评价。OPA 的稳定性和可重复性是临 床效果评价的前提条件，而胎牛血清作为细胞分化 和调理缓冲液配制中的重要试剂，在美国阿拉巴马 大学发布的“肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体多型 调理吞噬试验手册”中明确规定“由于非特异杀伤 等问题，需要对配制 OBB 的胎牛血清进行筛选。” 胎牛血清的主要成分为蛋白质、多肽、激素等，在含 量或特殊成分浓度、质量的差别可以对细胞的生长 造成影响。胎牛血清成分复杂，而促进细胞生长 的作用机制也同样复杂，目前仍有某些成分不清楚 或者作用机理尚在探索中。



 

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