大鼠肠黏膜损伤的修复作用研究（Vortex-5使用）

肿瘤是危害全人类健康的常见疾病和多发疾病，目 前临床上常用的肿瘤治疗策略主要有手术、化疗、分子 靶向抑制剂以及生物药疗法，常规化疗仍然是临床治疗 肿瘤的主要方式。其中，以5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）为代表的抗代谢类化疗药在化疗中占据约 40％的比重 。5-FU作为最早应用的抗代谢类化疗药， 已在临床上广泛用于胃肠道癌、肝癌和胰腺癌等实体 肿瘤的治疗，尤其在消化道肿瘤的治疗上占据主导地位 。

1 材料

1.1 仪器

Max190全波长酶标仪（美国Spectra公司）；L420离 心机（湘仪离心机仪器有限公司）；TANKPE060 纯水仪 （美国 Millipore 公司）；BSA224S-CW 电子天平[赛多利 斯科学仪器（北京）有限公司]；Vortex-5 涡旋混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；EG1150C石蜡包埋 仪（德国徕卡公司）；2000-C倒置显微镜、V.A1倒置荧光 显微镜（德国Zeiss公司）。

1.2 药品与试剂

人工蝉花由本实验室栽培，由南京中医药大学药学院于瑞莲副教授鉴定为蝉花（Isaria cicadae Miquel）菌 种的人工栽培品；5-FU注射液（天津金耀药业有限公司， 批号：1605081，规格：0.25 g/10 mL）；大鼠内毒素（ET）酶 联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号：H03A8E48592）、D乳酸（D-LA）ELISA试剂盒（批号：H02F4E48101）、分泌型 免疫球蛋白（sIgA）ELISA试剂盒（批号：H13C3E76192）、 肿 瘤 坏 死 因 子 α（TNF-α）ELISA 试 剂 盒（批 号 ： H06A2E50672）、γ-干扰素（IFN-γ）ELISA 试剂盒（批号： H06F6E23206）、白细胞介素15（IL-15）ELISA试剂盒（批 号：H03A3F06703）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）ELISA试剂盒（批号：H05A7E46872）、髓过氧化物酶（MPO） ELISA 试剂盒（批号：H03F8E34274）、丙二醛（MDA） ELISA 试剂盒（批号：H04A6E40382）、闭锁小带蛋白 ZO-1 ELISA 试剂盒（批号：H03A2E78452）均购自上海 源叶生物科技有限公司；DAPI染色液（南京建成生物有 限公司，批号：SUB- 30162）；兔源紧密连接蛋白Claudin 1-一抗（批号：ab240400）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二 抗（批号：ab150077）均购自美国Abcam公司。

1.3 动物

SPF级健康SD大鼠40只，♂，体质量（215±35）g， 由南京市青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证号： SCXK（苏）2017-0008。所有大鼠饲养于南京中医药大 学实验动物房内，环境温度为（23±2）℃、12 h/12 h昼夜 循环。饲养期间大鼠自由进食、饮水，适应性饲养1周后 进行实验。本实验遵守《实验动物护理和使用指南》，符 合动物常规伦理。

2 方法

2.1 动物分组与造模

将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组和人工蝉 花高、中、低剂量组，每组8只。除正常组外，模型组和人 工蝉花各剂量组大鼠均每天腹腔注射 1 次 30 mg/kg 的 5-FU，正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水，持续注射5 d。在此同时，人工蝉花高、中、低剂量组大鼠在注射 5-FU后1 h分别灌胃3.5 、1.75 、0.875 g/kg的人工蝉花溶 液（将干燥人工蝉花粉末用生理盐水制备的悬液，剂量 根据预实验结果和本实验室前期研究报道设置），正常 组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水；各组大鼠均每天 给药 1 次，连续给药 8 d，记录大鼠体质量等一般情况 变化。

2.2 血清中ET、D-LA含量测定

末次给药后2 h，大鼠腹主动脉取血，室温静置1 h，凝固收缩后，3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，然后 于－20 ℃保存，备用。按相应试剂盒说明书操作，检测 血清中 ET、D-LA 的含量，考察其对小肠黏膜生物屏障 功能的影响。

2.3 血清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15含量测定

取“2.2”项下血清，按相关试剂盒说明书操作，对血 清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15的含量进行测定，考察其 对小肠黏膜免疫功能的影响。

2.4 血清中MPO活性测定

取“2.2”项下血清，按试剂盒说明书操作，对血清中 G-CSF的含量进行测定。大鼠取血后，腹腔解剖取小肠 组织约40 mg匀浆[组织与生理盐水比为1 ∶ 10（mg/mL）]， 用于试剂盒检测，剩余部分病理组织检查待用。按检测 试剂盒说明书操作，对小肠组织中MPO活性进行测定， 考察其对小肠炎症因子的影响。

2.5 小肠组织中MDA含量测定

取“2.4”项下小肠组织，按检测试剂盒说明书操作， 对小肠组织中MDA的含量进行测定，考察其对小肠组 织过氧化水平的影响。

2.6 小肠黏膜病理学观察

将小肠于10％多聚甲醛溶液固定24 h，然后进行常 规组织包埋、石蜡切片等操作，经苏木精-伊红（HE）染色 后显微镜下观察小肠黏膜病理变化。

3 结果

给药前，各组大鼠间体质量差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药 8 d 后，与正常组比较，模型组大鼠体 质量显著降低（P＜0.01），此外还出现了明显的食欲不 振、精神萎靡、活力下降等症状。与模型组比较，人工蝉 花高剂量组大鼠体质量均显著升高（P＜0.01），食欲不 振、精神萎靡等情况也得到明显改善。与正常组比较，模型组大鼠血清中 ET、D-LA 含量 显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，人工蝉花高、中、 低剂量组大鼠血清中 ET、D-LA 含量均显著降低（P＜ 0.05或P＜0.01），且呈剂量依赖性趋势。与正常组比较，模型组大鼠小肠组织中MDA含量 显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，人工蝉花高、中、 低剂量组大鼠小肠组织中 MDA 含量显著降低（P＜ 0.01），并呈剂量依赖性趋势。正常组大鼠肠腔绒毛形态完整，隐窝结构清晰。模 型组大鼠肠绒毛剥落明显，隐窝结构散乱，可观察到大 量炎性细胞聚集，肠黏膜损伤严重。与模型组比较，人 工蝉花高、中、低剂量组大鼠的肠腔绒毛和隐窝结构形 态较完整，损伤程度较小；其中，人工蝉花高剂量、中剂 量组大鼠肠绒毛已接近正常，人工蝉花高剂量组大鼠隐 窝结构较为紧密、完整，人工蝉花低剂量组大鼠小肠组 织隐窝结构虽较正常组有一定程度的破坏、中性粒细胞聚集，但相比于模型组结构仍较好。

4 讨论

正常的肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫 屏障和生物屏障共同组成。通过对肠黏膜病理切片的 观察，发现5-FU化疗之后，大鼠小肠绒毛和隐窝结构均 受到了严重的损伤，导致肠黏膜屏障功能受到严重的影 响，机体无法正常地进行营养吸收，表现为体质量下降 和血清中ET含量显著升高。D-LA是肠道细菌代谢、裂 解的产物，当肠道缺血时，肠黏膜生物屏障破坏，此时肠 道中细菌产生的大量D-LA，通过受损的肠黏膜经循环 进入血液，检测血中D-LA水平可以反映肠黏膜受损程 度和通透性变化。本研究结果显示，模型组大鼠血清 中D-LA含量显著升高，灌胃人工蝉花后，肠黏膜得到明 显保护，血清中ET和D-LA含量均显著降低，并且大鼠 因化疗造成的体质量下降的情况也有显著的改善，表明 人工蝉花对5-FU化疗后破坏的肠黏膜营养吸收以及肠 黏膜生物屏障有明显的保护作用。



 

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