多重PCR快速检测方法研究(其林贝尔MTH-012使用)

近年来，食源性疾病屡见不鲜，其中主要的食源 性致病菌有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和 蜡样芽孢杆菌等，可导致腹泻、呕吐、痢疾等多种疾病，严重者可造成死亡，因此，食品产品中要求不得检出。 常规微生物学方法检测食源性致病菌，通常需要经过 富集培养、形态观察、生理生化鉴定等的过程，耗时耗 力，且主观性强，极易导致样品菌种的流失，出现阴性 结果，不能及时的发现并控制潜在的危险。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

蜡样芽孢杆菌 （CMCC63302）、金黄色葡萄球菌 （CMCC26003）、宋内氏志贺氏菌（CMCC51334）、鼠伤 寒 沙 门 氏 菌 （CMCC50115）、 大 肠 埃 希 氏 菌（CM－ CC44752）、铜绿假单胞菌（CICC21636）、苏云金芽孢杆 菌（CICC22945）、绿脓杆菌（CMCC10110）、阪崎肠杆菌 （ATCC51024）、副溶血性弧菌（CICC21617）、变形杆菌 （CMCC49027）、单增李斯特菌（CMCC54001），均保存 于河北农业大学生物工程实验室。 1.1.2 试剂 营养肉汤培养基：北京陆桥生物技术有限公司；琼脂糖：北京全式金生物公司；agar：索莱宝生物科技有 限公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒：天根生化科技有限公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）：康为世纪生物科 技有限公司；50 bp DNA Ladder：中科瑞泰生物科技有 限公司；ddH2O：河北农业大学生物工程实验室制备。

1.2 仪器与设备

其林贝尔MTH-012 型旋涡混合仪：海门其林贝尔仪器制造有限公司；070-851 型 PCR 仪：德国 Biometra 公司； DYY-10 C 型电泳仪：北京市六一仪器厂；JY04S-3E 型 凝胶成像分析系统：北京科普尔科技发展有限公司； UV-1700 型紫外分光光度计：上海优尼科公司；K5500 型超微量核酸测量仪：北京凯奥科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培养

分别挑取蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺 氏菌、沙门氏菌的单菌落，接种于 8 mL 灭菌的营养肉 汤培养基，37 ℃摇床 180 r/min 过夜培养。

1.3.2 模板的制备及计数

取 1 mL 过夜培养菌液，提取基因组 DNA 为模板， 具体操作方法见细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明书。 用核酸测定仪对 DNA 浓度及纯度进行测定。另取 1 mL 菌液，10 倍梯度稀释，涂布于固体肉汤培养基中， 37 ℃过夜培养，进行平板计数。

1.3.3 引物的设计与合成

针对蜡样芽孢杆菌的 gyrB、nheA 基因，金黄色 色葡萄球菌的 nuc、SED、MecA基因、志贺氏菌的 ipaH 基因和沙门氏菌的 ttr、sal、SiiA 基因，共设 计了 11 套引物，引物由上海生工公司合成，引物序列 及扩增片段长度等。

1.3.4 引物的筛选和确定

以11对引物分别对 4 种目的菌进行扩增，单一PCR 反应体系为：2×Es Taq Master Mix（Dye） 5 μL、20 μmol/L 上 下 游 引 物 各 0.2 μL，DNA 模 板 0.8 μL，加 ddH2O 补足到 10 μL。单一 PCR 反应程序 为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 变性 30 s，梯度设置退火 温度，退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，72 ℃再延伸 7 min，反 应 30 个循环。对 PCR 产物进行凝胶电泳分析，选择扩 增条带单一且大小不同、退火温度相似的引物，确定 为多重 PCR 引物组。

2 结果与分析

蜡样芽孢杆菌 gyrB 引物对在 52.5、55.7 ℃范围内条带明显，片段长 246 bp；金黄色葡萄球 菌 nuc 引物对在 52.5 ℃处有单一明亮条带，片段长 166 bp；志贺氏菌的 ipaHⅠ引物对在 52.6 ℃处单一明 亮条带，片段长 210 bp，ipaH Ⅲ引物对在退火范围内 条带单一，片段长 65 bp；沙门氏菌 SiiA 引物对在梯度 退火温度下条带单一明亮，片段长 107 bp，退火温度 相近且扩增出的片段长度不同，有利于多重 PCR 扩 增结果的判断，最终选择 gyrB、nuc、ipaHⅢ、SiiA 引物 对为多重 PCR 反应的引物组。当退火温度在这个范围内间均能得 到 4 条目的带，且条带区间明显，故证明本研究建立的 多重 PCR 体系，可特异性扩增出目的条带，且其大小 与预期扩增基因片段大小一致，但在 53.9 ℃之前条带 略暗，退火温度为 53.9 ℃ 时条带更加清晰明亮，因此，选定 54 ℃作为多重 PCR 的最适退火温度。但多重 PCR 扩增的志贺氏菌 65 bp 与金黄色葡萄球菌 166 bp 条带相对暗一些，故对 4 组引物对的加入量进行优化。测得 1mL 蜡样芽孢杆菌的核酸浓度为 52.649ng/μL， 对应菌落浓度为 1.5×107 CFU/mL；1mL 金黄色葡萄球菌的 核酸浓度为 14.245 ng/μL，对应菌落浓度为 108CFU/mL； 1 mL 志贺氏菌的核酸浓度为 357.78 ng/μL，对应菌落 浓 度 为 108 CFU/mL；1 mL 沙门氏菌的核酸浓度为 108.32 ng/μL，对应菌落浓度为 1.05×108 CFU/mL。用 ddH2O 10 倍梯度稀释提取的 DNA 模板，取 0.8 μL 进 行多重 PCR，测定其检出限。

3 讨论

目前，普通 PCR 技术在食品检测、疾控检测中， 已经相当成熟，相对于传统的生化特性检测，有着快 速、特异、灵敏度高的特点。在简单的 PCR 基础上，多 重 PCR 融合了普通 PCR 方便、快捷的优点，加入多个 引物对，可进行多个菌种多个样品的快速分析，简单 易操作，无需昂贵的仪器和专业的实验人员，也可进 行准确的分析，为快速发展的食品检测行业，提供了 很好的理论和技术基础。由于多重 PCR 是在同一反 应下进行的，节约成本，因此相对于常规的单重 PCR 来说，大大缩短的检测时间，提高了检测效率。食 品检测的快速发展，多重 PCR 方法以其特异性强、灵 敏度高等优点被广泛应用于食源性致病菌的快速检 测中。



 

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