蜡样芽孢杆菌分析（其林贝尔QL-866使用）

1 引 言

蜡样芽孢杆菌作为一种常见的食源性致病微生物, 广泛存在于水、空气、土壤等可能与食品接触的环境中, 较 容易引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)属于兼 性喜氧菌, 革兰氏阳性杆菌。在 20~45 ℃生长较好, 而在 10 ℃或 10 ℃以下生长缓慢或不生长, 而在 100 ℃加热一 定时间即可杀死该菌。由于毒性因子及生长环境的不同, 一些蜡样芽孢杆菌在食品行业和畜牧上会被作为益生菌添 加到食品和饲料中,有的菌株则为条件性致病菌,对食品 健康以及人们生存环境造成影响巨大。蜡样芽孢杆菌分布 较广,在生熟制品食品中较常见,容易造成食物中毒。而食 物放置时间较长或保存温度不当, 容易使污染的蜡样芽孢 杆菌繁殖, 从而产生毒素引起中毒。在美国, 引发蜡样芽 孢杆菌食物中毒的主要原因是炒米饭; 在欧洲主要由牛 奶、肉类食品和甜品引起,在我国主要与受污染的米饭或淀 粉类制品有关。呕吐和腹泻是蜡样芽孢杆菌的中毒典型 症状,与其他细菌毒素导致的中毒症状较相似, 如金黄色 葡萄球菌肠毒素, 二者都能导致急性的恶心与呕吐症状, 因此, 容易低估蜡样芽孢杆菌所导致的食物中毒事件。

2 材料与方法

2.1 试剂、仪器与材料

蜡样芽孢杆菌 (CMCC63303) 、金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、单增李斯特 菌(ATCC 19115)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、苏云金芽孢 杆菌、大肠埃希氏菌 (CMCC44102) 、贩崎肠杆菌 (ATCC29544)(广东环凯微生物科技有限公司)。 兔抗蜡样芽孢杆菌抗体(实验室自制)。 营养琼脂、营养肉汤、显色培养基(青岛海博生物技 术有限公司)。 甘油、十二水合磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、 氯化钾、吐温-20、脂肪酸甲酯磺酸盐(分析纯, 国药集团化 学试剂有限公司); PBS 缓冲溶液(0.01 mol/L, pH 7.4, 实验 室自制)。 DPX-9162B-2 电热恒温培养箱 ( 上海福玛公司 ); YXQ-LS-50 立式压力蒸汽灭菌锅 ( 上海博迅公司 ); GL3202-1SCN 电子天平 ( 瑞士梅特勒 - 托利多公司 ); UNIVERSAL 320R 高速离心机(德国 Hettich 公司); QL-866 旋涡振荡器(江苏其林贝尔公司); BSC-1500 B2 Ⅱ -X 生物安 全柜(鑫贝西 Biobase 公司); SHZ-82 恒温振荡器(常州润华 仪器公司); 磁力架(天津倍思乐公司); HH-S 恒温水浴锅 (金坛医疗公司); -80 ℃冰箱(中科美菱公司)、milli-Q 超纯 水仪(美国 Milipore 公司)。 炒青菜、鸡丝花菜、红烧肉、卤鸭肉(河南省科高食 品安全检测有限公司提供)。

2.2 方 法

2.2.1 蜡样芽孢杆菌菌种活化

(1) 取出低温保存的蜡样芽孢杆菌菌种, 接种于营养 琼脂斜面, 37 ℃恒温培养。
(2) 挑取单菌落, 接种于营养肉汤中, 30 ℃振荡 200 r/min, 培养 10 h。 取 1 mL菌液放入 1.5 mL 环氧树脂管(epoxy pipe, EP) 中, 离心去上清, 加入新鲜培养基 500 μL 后, 加入等体积 的灭菌 20%的甘油, 保存于-70 ℃冰箱。

2.2.2 抗体添加量的确定

分别加入不同含量的蜡样芽孢杆菌抗体到蜡样芽孢 杆菌培养液中(稀释至 104 CFU/mL)。取 100 μL 的细菌培养液加入到 100 μL 磁珠(100 mg/mL)中, 37 ℃振荡吸附 15 min, 静置磁力架上 2 min 分层, 弃上清液, 重复洗涤 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液振荡重悬磁珠, 涂 于显色培养基, 30 ℃培养 24 h 观察。

2.2.3 免疫磁珠添加量的确定

分别取不同添加量的免疫磁珠, 加入到 1 mL 蜡样芽 孢杆菌培养液中(稀释至 104 CFU/mL), 37 ℃振荡吸附 15 min, 静置磁力架上 2 min 分层, 弃上清液, 重复洗涤 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液振荡重悬磁珠, 涂 于显色培养基, 30 ℃培养 24 h 观察。

2.2.4 免疫磁珠与菌液最佳反应时间

分别取偶联磁珠 100 μL, 加入到 1 mL 蜡样芽孢杆菌 培养液中, 37 ℃振荡吸附 5、10、15、20、25 min 后, 静置 磁力架上 2 min 分层, 弃上清液, 重复洗涤 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液振荡重悬磁珠, 吸取 50 μL 涂于显 色培养基, 30 ℃培养 24 h 观察。

2.2.5 免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的敏感性试验

将蜡样芽孢杆菌菌液, 按一定梯度进行倍比稀释。取 100 μL 免疫磁珠分别加入到 1 mL 的经稀释至 104 CFU/mL 的蜡样芽孢杆菌培养液中, 37 ℃振荡吸附 15 min, 静置磁 力架上 2 min 分层, 弃上清液, 重复洗涤 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液振荡重悬磁珠, 然后涂于显色培养 基, 30 ℃培养 24 h, 观察平板上菌落的生长状况。

2.2.6 免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的特异性试验

将 100 μL 免疫磁珠, 分别加入到 1 mL 蜡样芽孢杆 菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希氏菌和贩 崎肠杆菌混合液中。37 ℃振荡吸附 15 min, 静置磁力架上 2 min 分层, 弃上清液, 重复洗涤 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液振荡重悬磁珠, 然后涂于显色培养基, 30 ℃培 养 24 h, 观察平板上菌落的生长状况。

2.2.7 熟制样品的检测

分别称取 25 g 炒青菜、鸡丝花菜、红烧肉、卤鸭肉 为基质样品, 每份样品中加入 225 mL 稀释液, 分别接种蜡 样芽孢杆菌(CMCC63303)(104 CFU/mL)制备样品。充分混 匀(所有样品均质 2 min), 加入免疫磁珠, 37 ℃振荡吸附 15 min, 磁分离 2 min, 取上清, 并用 PBS 洗涤。并作空白 对照, 涂于显色培养基, 30 ℃培养 24 h, 观察平板上菌落 的生长状况, 并计算捕获率。

3 结果与分析

当抗体量添加过低时, 富集到的细 菌数较少, 随着抗体量的增多, 富集到的细菌数也越来越 多。但超过了一定浓度细菌数并不增加, 所以选用蜡样芽孢杆菌抗体添加量为 50 μg/mL。对每个稀释度铺板培养后进行菌落计数, 利用蜡样芽 孢杆菌免疫磁珠富集分离敏感性可达到 4 CFU/mL, 而直接 平板计数法(GB 4789.14-2014 《食品安全国家标准 食品微 生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》)已经不能检出菌落。

4 小 结

通过对免疫磁珠添加量免疫磁珠与菌液最佳 反应时间免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的敏感性试验、特异性 试验的研究, 确定了蜡样芽孢杆菌免疫磁珠添加量 100 μL, 免疫磁珠与菌液最佳作用时间为 15 min, 免疫磁珠法检测 灵敏度底限为 10-7, 相应的细菌浓度为 4 CFU/mL, 免疫磁 珠具有较好的灵敏度和特异性。在食品基质中能达到较好 效果。

 

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