柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究

赣南脐橙是对外贸易中颇具竞争力的农产品， 它具有口感好，营养物质丰富等优点。自2000年 以来，赣南脐橙的种植面积逐渐扩大，其病害问题也 接踵而至，尤为严重的是柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）。HLB 病原菌有三个种，流行最 广 的 是 亚 洲 种（Candidatus liberibacter asisaticus， Las），该病主要通过木虱和苗木调运进行传播。 HLB 的常见症状为黄梢、叶斑驳黄化和红鼻子果， 该病症状很容易与其他柑橘病害混淆，例如柑橘衰 退病染和缺素症。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验地点与品种

本研究中柑橘黄龙病监测 点在江西赣州市寻乌县吉谭镇果园，该果园面积约 为6 hm2 ，品种均为脐橙，树龄是10 a左右，果园所处 地貌是为南方常见丘陵地形。当地果农严格施药， 对木虱进行严格防控，调查未发现木虱。

1.1.2 引物与探针

参照 Li 等设计的引物 HLBas/HLBr 和探针 HLBr，以此结合本实验室条件建 立 TaqMan 荧光定量检测体系。此外使用 M13F/ M13R验证含有目的片段载体的阳性克隆。引物和 探针由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物 和探针详情。

1.1.3 试剂耗材及仪器

实验中所用试剂包括植物全基因组 DNA 提取试剂盒（Axygen，美国），质粒小 提试剂盒（Axygen，美国），Mpbio Fastprep Lysing A 裂 解 介 质 管（Axygen，美 国 ），DEPC 水（DNase/ RNase-Free/water）（北京索莱宝科技有限公司，中 国），Probe qPCR Mix（宝日医生物技术（北京）有限 公司 ，中国），LB 培养基（Tryptone 15 g，Yeast extract 10 g，NaCl 10 g，pH 7.0），无水乙醇（国药集团 化学试剂有限公司，中国），PBS缓冲液（HyClone，美 国）等。实验所用仪器有普通离心机（Eppendorf，德 国），PCR 仪 和 凝 胶 成 像 分 析 系 统（美 国 ，BIORAD），超低温冰箱 MDF-382E（SANYO，日本）与恒 温冰箱（海尔，青岛），QuantStudio® 6 Flex及核酸蛋 白分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国），美国 MPFastPrep-24 5G 研磨机（MP Biomedicals，美国），微 孔板离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中 国）等。

1.2 方法

1.2.1 病害情况调查方法

本实验根据袁亦文等2010年制定的柑橘黄龙病病情分级标准，将果园分 为 5 个病级，其中 1 级：树上有 5~6 梢叶片呈现斑驳 黄化症状；2级：部分侧枝或者主枝出现斑驳黄化症 状，占全树的三分之一以下；3 级：带有斑驳黄化叶 的侧枝或主枝占全树的 1/3~2/3；4 级：带有 HLB 症 状树枝占三分之二以上；5级：全树接近死亡。从1~ 5级区分别选取5株树，共25株树。

1.2.2 植物组织总DNA提取

称取约 100 mg柑橘 叶片中脉，切碎后装入Mpbio Fastprep Lysing A裂解介质管，加入 500 mL PBS 缓冲液，用 MP FastPrep24 5G 研磨机研磨，程序设置：speed 6 m·s -1 ，time 40 s，Quantity 100 mg，cycles 2，pause time 300 s。植物 总 DNA 试 剂 盒 提 取 方 法 参 照 Axygen® 的 Multisource Genomic DNA Miniprep kit 250-prep 说明书， 将提取的DNA放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 质粒标准品的制备

由北京六合华大科技公 司将HLBas/HLBr扩增片段连接到pUC57-simple载 体上 ，再转化进入大肠杆菌中 ，使用引物 M13F/ M13R进行50 mL体系的PCR验证，验证有条带的阳 性菌液送至华大基因公司进行测序 ，利用 DNAMAN比对验证。取阳性菌液，利用质粒小提试剂盒 提取质粒。

1.2.4 质粒模板拷贝数计算公式

使用核酸蛋白分 析仪测定核酸浓度，将其作为 Las 质粒标准品。将 DNA 的质量浓度转化为模板拷贝数（copy number， CN）:CN=（M×N）（/ L×D），M=质量浓度（g · mL- 1 ）= DNA（ng · mL- 1 ）×10- 6 ，N=阿伏伽德罗常数（6.022× 1023分子/摩尔），L=核酸分子长度（总长度=靶片段+ 载体，单位 kb），D=转换因子（对 dsDNA 为 6.6×105 g·mol-1 ·kb-1 。

2 结果与分析

将 HLBas/HLBr 扩增片段连接到 pUC57-simple 上得到载体pUC57-Las，使用引物M13F/M13R扩增 得到 211 bp特异条带。测序后使用 DNAMAN进行 序 列 比 对 ，与 Las 基 因 组 中 相 应 序 列 相 似 性 为 100%，验证结果正确。标 准 曲 线 y=- 3.369 lg（x）+ 15.738（R2 =0.999， Eff%=98.068）。 y 为 CT 值 ，x 为 DNA 浓 度 ，单 位 ng · mL-1 。将 DNA 浓度转化模板拷贝数，得到公式 Y=−3.369 lg（CN）+44.422（Y 为 CT 值，CN 为模板拷 贝数）。

3 讨 论 

对江西省赣州地区柑橘黄龙病菌在染病 柑橘树体内的流行动态规律进行了监测，发现在 2017 年 8 月到 2018 年 10 月，Las 在树体内的含量会 随着时间变化而波动大体呈现出 2个高峰和 2个低 谷，总体表现为 2017 年 8 月开始 Las 含量先增后降的变化规律。胡浩研究了广西柳州地区染病柑橘 树内 Las含量的动态变化，结果显示在 10 月柑橘黄 龙病菌含量达到最高值，在 3 到 5 月维持在较低水 平。Wang等研究显示Las在染病柑橘树体内变化 规律为在 10月和 12月柑橘黄龙病菌含量达到最高 值，3月和5月维持在较低水平。以上研究均发现在 10月份病树内的 Las含量会达到高峰，5月 Las含量 处于低谷，但本研究中江西柑橘果园内病树的 Las 含量在 6 月也呈现出 1 个高峰。该时段的 Las 含量 较 10 月份的 Las 含量低，但仍是低谷时期 Las 含量 的 10 倍以上。本研究的结果与前人研究结果存在 差异的原因可能是不同果园地理位置气候或者柑橘 自身生长规律的差异导致的。此外本研究果园里的 木虱受到果农严格控制，定期施药，所以木虱对植株 体内 Las 的含量影响较小，与前人的研究结果相互 对比分析，木虱对病树后期 Las 含量的变化影响不大。



 

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