乙酰化衍生物在SD大鼠体内药动学研究(VORTEX-5使用

藤茶［Ampelopsis grossedentata ( Hand． -Mazz． ) W． T． Wang］属葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本 植物，主要分布于我国长江流域，始载于《茶经》，作 为民间日常饮用茶，其入药记载初见于《草本便 方》: “藤茶叶甘温消渴，诸气鼓胀月活，丹停气肿下 盅毒，利便通肠代茶喝”。研究表明藤茶具有杀 菌消炎、抗氧化、保肝、预防癌症等作用，主要活 性成分为二氢杨梅素( dihydromyricetin，DMY) ，另含 有杨梅素( myricetin，MY) 等其他黄酮类化合物，其 茎叶 DMY 含量可达 30%，近年来研究报导 DMY 和 MY 具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、预防动 脉粥样硬化等药理作用，是极具开发前景的天 然药物成分。

1 材料和试剂

1． 1 仪器

HPLC 系统( 岛津公司，日本) ，AB SCIEX 4000 Q TＲAP LC-MS /MS 系统和 Analyst software 1． 6． 1 工作站( AB SCIEX 公司，美国) ，VOＲTEX-5 旋涡振荡器( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司， 中国) ，低温高速冷冻离心机( Sigma 公司，3-18K，德 国) ，超低温冰箱( 三洋公司，日本) 。GH-202 电子 分析天平( AND，日本) 。

1． 2 试药

二氢杨梅素衍生物的合成 3，5，7，3’，4’，5’-六乙酰基二氢杨梅素( 3，5，7，3’，4’，5’- hexaacetyl dihydromyricetin，DMY-1) 与 3，3’，4’，5’- 四乙酰基二氢杨梅素( 3，3’，4’，5’-tetraacetatyl dihydromyricetin，DMY-2) 合成方法详细见课题组的前期研究，简述如下: 藤茶经过提取、分离、纯化 获得 DMY 和 MY。一定量的 DMY 与乙酸酐和高氯 酸在室温下发生反应获得白色固体，将干燥的白色 固体进行重结晶，得到纯度为 84． 3% 的 DMY-1。同 理，一定量 DMY 与乙酸酐和原硼酸发生反应，乙醇 重结晶，得到纯度为 88． 2% 的 DMY-2。 二氢杨梅素对照品 ( 含 量: 98． 0% ，批 号 150507) ，杨 梅 素 对 照 品 ( 含 量: 98． 0% ，批 号 150311) ，异甘草素对照品( Isoliquiritigenin，ISL，含 量: 100． 0% ，批号 140928) 作为检测内标( internal standard，IS) ，均购买于长沙昂诺生物科技有限公 司; 二氢杨梅素原料药( 含量: 98． 0% ，湖南中医药 大学天然药物化学实验室自制) ，杨梅素原料药( 含 量: 98． 0% ，湖南中医药大学天然药物化学实验室自 制) ; DMY-1、DMY-2 为湖南中医药大学天然药物化 学实验室自制，经 HPLC 归一化法分析含量分别为 84． 3% 和88． 2% 。甲醇和乙腈( 色谱纯，Merck，Germany) ，甲 酸 ( 色 谱 纯，ＲOE scientific inc． ，USA， LOT0J0921) ，纯净水由实验室的纯水仪所制( ＲODI12AL，AQUA SOLUTIONS ，INC，美国) 。

1． 3 动物

24 只 SD 大鼠，质量 200 ～ 250 g，雌雄 各半，购于湖南省斯莱克景达实验动物有限公司， 许可证号: SCXK( 湘) 2011-0003，饲养于中南大学湘 雅二医院实验动物房，实验单位使用许可证编号: SYXK( 湘) 2012-003。

2 方法与结果

2． 1 色谱与质谱条件

色谱条件: 色谱柱为 Ultimate AQ-C18 ( 3． 0 mm × 100 mm，3． 0 μm) ，Welch Materials; 预柱: SecurityGuardTM Cartridges C18 ( 4 × 3． 0 mm) ，美国菲罗门公司; 流动相 A 为水相: 0． 1% 的 甲酸-水溶液，流动相 B 为有机相: 纯乙腈，梯度洗脱 程序为 10% B( 0． 01 ～ 0． 30 min) ，10 ～ 70% B( 0． 30 ～ 1． 90 min) ，70% B( 1． 90 ～ 3． 50 min) ，70 ～ 10% B ( 3． 50 ～ 3． 70 min) ，10% B( 3． 70 ～ 6． 40 min) ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ( 0． 01 ～ 0． 40 min) ，0． 6 mL·min － 1 ( 0． 50 ～ 6． 10 min) ，0． 4 mL·min － 1 ( 6． 10 ～ 6． 40 min) ; 柱温 45 ℃。

2． 2 标准溶液配置及标准曲线制备

DMY、MY 及 ISL( IS) 对照品分别用纯甲醇溶解配置得到标准储 备液为 800，620，480 μg·mL － 1，放置 － 20 ℃ 冰箱保 存。将空白血浆加入标准储备液配成 DMY 的标准 曲线质量浓度为1． 0，2． 5，5． 0，10． 0，50． 0，200． 0， 800． 0 和 1 200． 0 ng·mL － 1，质控样品质量浓度为 2． 0，60． 0，1 000． 0 ng·mL － 1，MY 的标准曲线质量浓度 为 1． 0，3． 0，6． 0，18． 0，30． 0，60． 0，120． 0 和 150． 0 ng·mL － 1，质控样品浓度为 2． 5，50． 4，132． 0 ng· mL － 1，内标沉淀剂浓度为 14． 4 ng·mL － 1。所得结果 表明 DMY 在浓度为 1． 0 ～ 1 200． 0 ng·mL － 1、MY 在 1． 0 ～ 150． 0 ng·mL － 1 的血浆中的线性关系良好， DMY 和 MY 在血浆中的线性方程分别为: Y = 0． 016 7X + 0． 055 5( r = 0． 999 6) ，Y = 0． 019 8X + 0． 004 32 ( r = 0． 999 2) ，最低定量限均为 1． 0 ng·mL － 1，最低 定量限考察的 ＲSD 均小于 12． 0% 。

2． 3 样品处理

将血浆样品从 － 70 ℃ 冰箱取出室 温下解冻，涡旋混合30 s，精密吸取30 μL 血浆置1． 5 mL EP 管内，加入 90 μL 内标沉淀剂( ISL 14． 4 ng ·mL － 1 ) ，涡旋振荡 3 min 后，离心 10 min( 15 000 r· min － 1 ) ，取上清液 60 μL 与去离子水 60 μL 混合入 进样瓶，进样 5μL，以内标法定量分析。

3 讨论

DMY、DMY-2、MY 在 ESI 源负离子采集模式下均能获得较高的灵敏度和 高选择性，但是 DMY-1 只能在 ESI 源正离子模式下 才能获得质谱响应，见图 1 所示。DMY、MY、DMY2、ISL 和 DMY-1 的质谱调谐后的离子对分别为 m / z 319． 0 →192． 9、m / z 317． 1 →179． 0、m / z 487． 3 → 403． 2、m / z 255． 0→118． 9 和 m / z 590． 4→489． 3。为 获得最佳灵敏度和峰型，分别比较了甲醇、乙腈与 含不同比例的甲酸、醋酸铵水溶液对待测物进行色 谱分离，结果表明: 水相中只添加0． 1% 甲酸比含有 缓冲盐更能改善色谱峰型。因此本研究最终在水 中加 0． 1% 甲酸作为水相来进行色谱分离。此外， 为了满足同时分析检测这 5 个化合物，采用梯度洗 脱能 够 实 现 快 速 分 离，DMY、MY、DMY-2、IS 和 DMY-1 的保留时间分别是4． 00，4． 26，5． 00，4． 73 和 5． 30 min，总运行时间为 6． 4 min，相比于报道 的进样时间，得到很大的改善，实现了快速分离。



 

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